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申请/专利权人：广西大学

摘要：本发明公开了一种新型奶水牛乳腺炎快速ELISA检测方法，其特征在于：该新型奶水牛乳腺炎快速ELISA检测方法包括如下步骤：步骤一：ELISA检测试剂盒制备：ELISA检测试剂盒包括以下成分：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌蛋白抗原包被的ELISA板，阴性对照血清、阳性对照血清、样品稀释液、封闭液、洗涤液、酶标记二抗、显色液和终止液；S1：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌蛋白抗原的制备过程：使用200rmin的恒温振荡仪分别振荡培养3种病原菌6h，并在12000rmin下离心5min去上清，加入PBS重悬2～3次。最后再超声冰浴破碎菌液至清亮。该新型奶水牛乳腺炎快速ELISA检测方法及应用，操作时间短、易操作、特异性强还具有目视检测等优点。

主权项：1.一种新型奶水牛乳腺炎快速ELISA检测方法，其特征在于：该新型奶水牛乳腺炎快速ELISA检测方法包括如下步骤：步骤一：ELISA检测试剂盒制备：ELISA检测试剂盒包括以下成分：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌蛋白抗原包被的ELISA板，阴性对照血清、阳性对照血清、样品稀释液、封闭液、洗涤液、酶标记二抗、显色液和终止液；S1：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌蛋白抗原的制备过程：使用200rmin的恒温振荡仪分别振荡培养3种病原菌6h，并在12000rmin下离心5min去上清获得的菌泥，加入PBS重悬2～3次，每次以12000rmin离心1min，取最后一次菌悬液1mL，调整为1×108CFUmL，再次加入20μL50mgmL的溶菌酶和1μL100mM的PMSF，然后37℃恒温反应30min，最后再超声冰浴破碎菌液至清亮，分别保存于-20℃冰箱；S2：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌阳性对照血清及阴性对照血清的制备过程：S2.1：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌分别加入营养肉汤，并在200rmin恒温振荡器中振荡培养12h；S2.2：按照1:10的比例将菌液稀释107、108、109倍，将稀释后的菌液分别涂布在营养琼脂培养基上，并将培养基放到37℃恒温的培养箱倒置培养24h；S2.3：通过平板计数法，推算原菌液细菌浓度，调整菌液的浓度均为2.5×l09CFUmL，然后加入甲醛灭活，调整甲醛的终浓度为0.3％，同时取灭活后的菌液100μL涂布在营养琼脂培养基上，再次放到37℃恒温的培养箱内部倒置培养24h，若平板内无菌生长，即为灭活成功；S2.4：将灭活成功的菌液在常温离心机下12000rmin离心5min，弃上清后收集沉淀，并用无菌生理盐水重悬2～3次，每次以12000rmin离心1min，最后用无菌生理盐水恢复至原浓度；S2.5：购买9只6斤左右雌性SPF兔子，先通过玻片凝集试验采集无特异性抗体的阴性血清，再分组进行阳性血清制备，首免采用弗氏完全佐剂与灭活菌液形成油包水乳液，每只兔子按照2mL只对其背部进行多点皮下免疫，二免及三免改用弗氏不完全佐剂与灭活菌液形成油包水乳液，按3mL只背部皮下多点注射，免疫时间各间隔2周，在最后一次免疫两周后耳缘静脉采血，分离血清存储于-20℃保存；S3：碳酸盐缓冲液配置为：往450mL蒸馏水中加入0.75gNa2CO3和1.46gNa2HCO3，使用NaOH来将溶液的pH值调整至9.6，然后加蒸馏水定容至500mL；S4：磷酸盐缓冲液PBS配置为：往900mL蒸馏水中加入8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,使用HCl将溶液的pH值调整至7.4，最后加蒸馏水定容至1L；S5：稀释液的配置为：往100mL的碳酸盐缓冲液加入0.2gBSA，混匀后室温保存；S6：封闭液洗涤液的配置为：往50mL磷酸盐缓冲液加入0.5gBSA，混匀后室温保存；S7：洗涤液的配置为：往500mL磷酸盐缓冲液加入1mLTween-20，将其pH值调整为7.0-7.2，混匀后室温保存；步骤二：一种新型奶水牛乳腺炎快速ELISA检测方法，包括如下步骤:S1：将三种病原菌抗原用稀释液稀释后分别以每孔100μL体积包被酶标板，并在4℃下培养一夜；S2：然后弃去包被液，将PBST洗涤酶标板3-4次，每次2min；S3：每孔加入100μL封闭液，放入37℃恒温培养箱孵育1h，孵育完成后弃去封闭液，PBST洗涤酶标板3-4次，每次2min；S4：每孔加入稀释好的100μL一抗血清，设置阴性对照和阳性对照，阴性对照加入阴性血清，阳性对照加入制备好的阳性血清，然后放入37℃恒温培养箱孵育1-2h，随后弃去一抗液体，PBST洗涤酶标板3-4次，每次2min；S5：每个孔加100μL酶标记二抗，放入37℃恒温培养箱孵育40min，孵育完成后弃去二抗液体，PBST洗涤酶标板3-4次，每次2min；S6：每个孔加100μL的底物显色液，放入37℃恒温培养箱避光孵育15min，再加入100μL的ELISA反应终止液，显色时间可以情况而定；S7：在酶标仪测定450nm波长下的OD450nm值，检测结果为PN＝阳性血清OD值阴性血清OD值，PN≥2.1判定为阳性，否则为阴性。

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