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申请/专利权人：郑州大学

摘要：本发明涉及增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法及其应用，可有效解决传统注射型疫苗依从性差、黏膜免疫反应低的问题，其解决的技术方案是，该增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗是通过化学法提取粪产碱杆菌细胞壁，利用去溶剂化法制备负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒，之后使用机械挤压法在纳米粒表面包被上粪产碱杆菌细胞壁，即得粒径为150‑250nm的口服纳米疫苗，本发明制备条件温和，工艺简单，方法稳定可靠，生产费用低，制备的增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗可以促进免疫球蛋白A的产生，有效激发肠道黏膜免疫应答，预防黏膜病原体的感染，拓开了肠道黏膜免疫的新思路。

主权项：1.一种增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗的制备方法，其特征在于，该增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗是通过化学法提取粪产碱杆菌细胞壁，利用去溶剂化法制备负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒，之后使用机械挤压法在纳米粒表面包被上粪产碱杆菌细胞壁，即得粒径为150-250nm的口服纳米疫苗，具体包括以下步骤：1）制备负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒称取0.5-1.5mg视黄酸溶解于0.5-1.5mL无水乙醇中，称取25-40mg抗原蛋白溶解于5-8mL无菌水中，将上述溶液混合后，加入10-20μL戊二醛作为交联剂，在室温下避光搅拌反应12-24h，反应结束后用离心机8000rmin离心10min，沉淀，即为负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒；2）制备粪产碱杆菌细胞壁碎片将粪产碱杆菌接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基中，在37℃培养箱中进行需氧培养，将活菌5000rmin离心5min分离出菌体，控制菌密度为1×107-1×108CFUmL，向该菌悬液中分别加入氢氧化钠、十二烷基硫酸钠和碳酸钙，使其终浓度分别为5-6mgmL、1.5-2mgmL、0.4-1μgmL，上述混合溶液在37℃孵育1-2h，6000rmin离心10min后收集沉淀，洗涤后重悬于无菌水中，得重悬液，向上述重悬液中加入30%过氧化氢溶液，使其终浓度为4%-4.5%，得混合液，上述混合液继续于37℃下孵育15-25min，6000rmin离心10min，收集沉淀，将沉淀用组织研磨仪研磨破碎，即得粪产碱杆菌细胞壁碎片；3）制备增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗将步骤1）制备的负载视黄酸的抗原蛋白纳米粒15-35mg和步骤2）制备的粪产碱杆菌细胞壁碎片20-40mg混合后重悬于4-5mL无菌水中，得混悬液，将该混悬液先后用含孔径为0.8μm和0.4μm聚碳酸酯膜的脂质体挤出仪来回挤压各4-6次，收集混悬液在14000rmin离心20min，沉淀，即为增强肠道黏膜免疫的口服纳米疫苗。

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