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申请/专利权人：江苏大学

摘要：本发明属于生物传感器技术领域，涉及基于CRISPR技术的光电化学‑比色双模式传感器检测Cry1Ab的方法。首先引入具有加强筋效应的茎环DNA促进异质结的形成，提高了载流子在界面的迁移效率；然后以Cry1Ab蛋白为概念验证，激活具有反式切割活性的CRISPR‑Cas12a系统，对ZIF基异质结进行剪切，导致内在异质结被破坏，界面载流子迁移消失，产生极性切换的光电化学信号。同时，从界面释放的ZIF‑Hemin作为纳米酶具有极好的过氧化物酶活性，产生比色信号；实现了极性切换的PEC信号和纳米酶赋能的比色信号的双信号获取，这两种信号具有独立的传输路径，可以相互验证，提高生物传感器的可靠性和准确性。

主权项：1.基于CRISPR技术的光电化学-比色双模式传感器检测Cry1Ab的方法，其特征在于，步骤如下：1NH2-rGO溶液的制备：首先，将rGO加入到乙醇水溶液中，超声分散均匀；并在搅拌条件下，依次加入APTES、乙二胺和HCl，继续搅拌一段时间，得到混合溶液；然后经离心收集沉淀物，分别用乙醇和超纯水离心洗涤，洗涤后的沉淀物再经干燥，得到氨基化rGO，记为NH2-rGO；最后，将NH2-rGO重新分散到超纯水中，得到NH2-rGO溶液；2CdSeQDs溶液的制备：a在氮气保护下，将硒粉和硼氢化钠溶解于超纯水中，获得硒氢化钠前驱体；b在氮气保护下，将氯化铬溶于超纯水中，然后加入3-巯基丙酸，形成混合液；调节pH后的混合液记为溶液A；在溶液A中通氮气一段时间后，再加入步骤a制备的硒氢化钠前驱体，所得混合溶液在微波合成仪中反应，反应后的溶液记为溶液B；将无水乙醇与溶液B混合，静置一段时间后经离心收集沉淀物，用无水乙醇离心洗涤，洗涤后的沉淀物经烘干后重新分散在超纯水中，得到CdSeQDs溶液；3NH2-rGOCdSe溶液的制备：将步骤1制备的NH2-rGO溶液与步骤2制备的CdSeQDs溶液混合，搅拌过夜，获得NH2-rGOCdSe溶液；4ZIF-Hemin-SLP溶液的制备：a将ZnNO32·6H2O和2-甲基咪唑分别溶于超纯水中，超声分散均匀，得到ZnNO32溶液和2-甲基咪唑溶液；在搅拌条件下，将ZnNO32溶液加入2-甲基咪唑溶液中，继续搅拌一段时间，然后经离心收集沉淀物，再将沉淀物分别用超纯水和乙醇离心洗涤、真空干燥后获得ZIF固体粉末；b将ZIF固体粉末加入超纯水中，超声分散均匀，得到ZIF溶液；将溶于二甲基亚砜的血红素加入到ZIF溶液中，搅拌反应一段时间后，经离心收集沉淀物；用二甲基亚砜离心洗涤，将洗涤后的产物重新分散于超纯水中，获得ZIF-Hemin溶液；c将ZIF-Hemin溶液与含1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲溶液混合，进行第一次搅拌反应，反应后加入茎环DNA继续搅拌反应，反应后经离心获得产物为ZIF-Hemin-SLP；最后，将ZIF-Hemin-SLP重新分散在超纯水中，获得ZIF-Hemin-SLP溶液；5活化CRISPRCas12a溶液的制备：将Cry1Ab蛋白的适配体与激活DNA进行杂交反应生成双链DNA，记为dsDNA；然后在dsDNA中加入Cry1Ab蛋白标准液，所得到的混合液记为混合液A；然后将Cas12a、crRNA和1×buffer混合后，记为混合液B，经孵育后得到未活化的CRISPRCas12a；最后将混合液A添加到未活化的CRISPR-Cas12a中，在一定温度下活化，获得活化CRISPRCas12a溶液；6将步骤3制备的NH2-rGOCdSe溶液修饰到ITO电极表面，经孵育后的产品标记为ITONH2-rGOCdSe；7将步骤4制备的ZIF-Hemin-SLP溶液修饰到步骤6所获得的传感器表面，经孵育后的产品标记为ITONH2-rGOCdSeZIF-Hemin-SLP；8将步骤5制备的活化CRISPRCas12a溶液修饰到步骤7所获得的传感器表面，经孵育后的产品标记为ITONH2-rGOCdSeZIF-Hemin-SLPCRISPRCas12a；9用HEPES缓冲溶液冲洗步骤8制备的ITONH2-rGOCdSeZIF-Hemin-SLPCRISPRCas12a电极表面，收集清洗后的HEPES缓冲溶液；然后将H2O2和TMB依次加入清洗后的HEPES缓冲溶液中，反应一段时间后，得到混合液C，采集混合液C的比色信号，并以Cry1Ab蛋白标准液的浓度作为横坐标，比色信号作为纵坐标，建立标准曲线；10将步骤9用HEPES缓冲溶液冲洗过的传感器进行光电化学测试，得到光电化学信号；以Cry1Ab蛋白标准液的浓度作为横坐标，光电化学信号作为纵坐标，建立标准曲线；11实际样品Cry1Ab蛋白的检测：首先获取待测液，然后按照步骤5-10的操作，区别是将不同浓度的Cry1Ab蛋白标准液替换为待测液，最后获取比色信号和光电化学信号，代入对应的标准曲线，即可实现未知样品中Cry1Ab蛋白的检测。

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