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申请/专利权人：瑞泽恩制药公司

摘要：本文提供了一种方法，所述方法使用序列特异性核酸酶试剂例如，gRNA‑Cas复合物组装至少两个核酸以形成具有互补性的末端序列，随后组装所述重叠互补序列。所述核酸酶试剂例如，gRNA‑Cas复合物可以在dsDNA中形成双链断裂而形成重叠末端序列，或者可以在每条链上形成切口而产生互补悬垂末端序列。采用本文所述方法进行的组装可以组装任何具有重叠序列的核酸，或者可以使用接合寡核苷酸来组装不具有互补末端的序列。

主权项：1.一种用于组装两个或更多核酸的体外方法，包括：a使第一核酸与第一核酸酶试剂和第二核酸酶试剂接触，其中所述第一核酸酶试剂在第一靶位点处切割所述第一核酸，且所述第二核酸酶试剂在第二靶位点处切割所述第一核酸，以产生第一经酶切的核酸，其中所述第一核酸酶试剂包括：Cas蛋白和向导RNAgRNAgRNA-Cas复合物；锌指核酸酶；或转录激活因子样效应物核酸酶TALEN，以及其中所述第二核酸酶试剂包括：gRNA-Cas复合物；锌指核酸酶；或TALEN；b使所述第一经酶切的核酸与第一接合寡核苷酸、第二核酸、第二接合寡核苷酸以及核酸外切酶接触，其中所述第一接合寡核苷酸由以下组成：i与所述第一经酶切的核酸互补的第一互补序列和与所述第二核酸互补的第二互补序列，其中所述第一互补序列位于所述第一接合寡核苷酸的5'端，以及所述第二互补序列位于所述第一接合寡核苷酸的3'端；或ii与所述第一经酶切的核酸互补的第一互补序列、与所述第二核酸互补的第二互补序列、和所述第一互补序列和所述第二互补序列之间的间区序列，其中所述第一互补序列位于所述第一接合寡核苷酸的5'端，以及所述第二互补序列位于所述第一接合寡核苷酸的3'端；以及其中所述第二接合寡核苷酸由以下组成：i与所述第二核酸互补的第一互补序列和与所述第一经酶切的核酸互补的第二互补序列，其中所述第一互补序列位于所述第二接合寡核苷酸的5'端，以及所述第二互补序列位于所述第二接合寡核苷酸的3'端；或ii与所述第二核酸互补的第一互补序列、与所述第一经酶切的核酸互补的第二互补序列、和所述第一互补序列和所述第二互补序列之间的间区序列，其中所述第一互补序列位于所述第二接合寡核苷酸的5'端，以及所述第二互补序列位于所述第二接合寡核苷酸的3'端；以及其中所述第一接合寡核苷酸和或所述第二接合寡核苷酸为50bp至400bp的线性双链DNA，其中所述核酸外切酶暴露所述第一接合寡核苷酸、所述第二接合寡核苷酸、所述第一经酶切的核酸和所述第二核酸的互补序列；以及c将所述第一经酶切的核酸、所述第一接合寡核苷酸、所述第二核酸和所述第二接合寡核苷酸组装在一起，包括将所述第一经酶切的核酸、所述第一接合寡核苷酸、所述第二核酸、和所述第二接合寡核苷酸与连接酶、所述核酸外切酶、DNA聚合酶和核苷酸混合并在恒温下温育，并且其中所述组装包括：i使所述第一经酶切的核酸、所述第一接合寡核苷酸、所述第二核酸、和所述第二接合寡核苷酸退火，以及延伸退火的序列的3'端；以及ii连接所述第一经酶切的核酸、所述第一接合寡核苷酸、所述第二核酸、以及所述第二接合寡核苷酸，其中所述组装发生在一步等温反应中。

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