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申请/专利权人：北京市农林科学院;北京中海生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株及其制备方法和应用。具体为应用反向遗传操作技术，对信鸽新城疫病毒株PNDV‑YQ株的F蛋白3个裂解位点的氨基酸进行了定点突变，通过分段克隆的方式构建并获得了低毒力基因的全长cDNA质粒pOK‑YQ，再分别将PNDV‑YQ株的NP、P和L的ORF基因克隆至真核表达载体pCIneo，构建并获得了辅助质粒pCI‑NP，pCI‑P，pCI‑L。全长质粒与辅助质粒共转染BSR‑T7细胞后，拯救出重组致弱病毒，即鸽新城疫病毒PNDV‑aYQ株。该株病毒为低致病性或无致病性毒株，且具有良好的增殖特性和遗传特性稳定。以该病毒株制备的灭活疫苗，与现有鸡新城疫疫苗相比，该疫苗具有副反应低、免疫产生期早和保护率高的优点。

主权项：1.一种采用信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株制备新城疫灭活疫苗的方法，其特征在于：包括信鸽新城疫病毒基因工程弱毒株改造方法：选择基因VIb亚型信鸽源新城疫病毒YQ株，简称PNDY-YQ，作为改造病毒株，将PNDY-YQ的F蛋白裂解位点的第112位、115位和117位氨基酸进行了定点突变，通过分段克隆的方式构建并获得低毒力基因的全长cDNA质粒pOK-aYQ；再分别将PNDY-YQ的NP、P和L的开放阅读框基因克隆至真核表达载体pCIneo，构建并获得辅助质粒pCI-NP，pCI-P，pCI-L；全长cDNA质粒pOK-aYQ与辅助质粒pCI-NP，pCI-P，pCI-L共转染BSR-T7细胞后，拯救出重组致弱病毒，命名为鸽新城疫病毒aYQ株，简称PNDY-aYQ，即为所述信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株，步骤为：1）将PNDY-YQ株全长cDNA序列分成6段，分别扩增并连接在pMD1819载体上；对F蛋白裂解位点的3个氨基酸R112G，K115G，F117L进行突变，并在片段1前加入T7启动子序列，在片段6尾端引入丁型肝炎核酶序列和T7终止子序列；随后依次将各片段克隆至T7的pOK12载体中，将构建的质粒命名为pOK-aYQ；2）根据测定的PNDY-YQ株全长基因组序列，将NP，P和L的开放阅读框分别克隆至真核表达载体pCIneo的CMV启动子下游，构建的辅助质粒分别命名为pCI-NP，pCI-P和pCI-L；3）将步骤1）获得的全长cDNA质粒pOK-aYQ和步骤2）获得的3个辅助质粒pCI-NP，pCI-P和pCI-L用转染试剂Lipofectamine3000按照5:1:1:2的比例共转染BSR-T7细胞，转染6h后，更换含2%FBS血清和1%双抗的opti-MEM培养基；培养3天后收获培养液，接种10日龄SPF鸡胚，收集尿囊液，获得基因Ⅵb亚型低毒力鸽新城疫病毒株，命名为鸽新城疫病毒aYQ株，简称PNDY-aYQ，即为所述信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株；所述信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo：24460，制备新城疫灭活疫苗的方法如下：A、接种：将所述信鸽新城疫病毒基因工程改造弱毒株经尿囊腔途径按照106EID50枚的剂量，经尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，36～37℃孵育；B、收获：接种后88h，所有鸡胚放置2～8℃过夜，收获含有病毒的尿囊液，测定HA效价和病毒含量，HA效价应不低于1:256，病毒含量应不低于108.0EID500.1ml；C、初滤：经1μm滤膜或深层滤器过滤；获得初滤病毒尿囊液；D、浓缩洗涤：将初滤病毒尿囊液采用4000rpm离心30min，取上清用100KD或300KD超滤膜包将病毒液浓缩至原体积的13，采用等体积洗滤的方式，加入pH7.2～7.4、0.01molL的PBS，利用100KD或300KD超滤膜包洗涤纯化3次，获得浓缩病毒尿囊液，HA效价应不低于1:512；E、灭活：将浓缩病毒尿囊液按终浓度为0.1%～0.2%的比例加入甲醛溶液，37℃灭活24小时或4～8℃灭活10日，得到灭活病毒液，灭活病毒液HA效价应不低于1:256；F、疫苗制备：将灭活病毒液与ISA763AVG佐剂按水相和油相重量比3:7的比例混合乳化，将7份非矿物油佐剂注入乳化罐中，开动电机，缓慢搅拌同时慢慢加入3份水相灭活病毒液直接混合乳化获得所述新城疫灭活疫苗；所述的ISA763AVG佐剂经0.2μmPTFE滤膜过滤除菌。

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