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申请/专利权人：优赛生命科学发展有限公司

摘要：本发明公开了一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，制备步骤如下：通过对复苏的脐带间充质干细胞传代培养，并进行富集浓缩的方法，获得高浓度的具有生物活性的脐带间充质干细胞；配合海藻酸钠凝胶联合制备，获得具有高度稳定性、渗透性的脐带间充质干细胞凝胶。本发明凝胶通过体外对局部伤处进行涂抹的方式，促进伤处细胞生长，同时避免了细菌侵入，降低感染的可能性，为伤处提供有利于组织生长的微环境，从而促进外伤愈合、缩短治疗时间，减少伤者痛苦。使用操作简单、成品便于保存，降低伤者治疗成本，提高治疗效果。

主权项：1.一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶，其特征在于：制备步骤如下：1将体外分离获得的间充质干细胞以原代培养基进行细胞培养，37℃、5％CO2培养，3-4小时后翻面，使培养基浸润细胞，继续培养P0代细胞7-10天；2细胞融合度达到50％-70％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照4-6×103cm2接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P1代细胞；3细胞培养3-6天，细胞融合度达到50-80％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬，过滤，计数，根据计数结果按照1-2×104cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P2代细胞；4细胞培养2-4天后，细胞融合度达到80-90％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落；300-500g离心5-8分钟，去上清，细胞沉淀用培养基重悬后过滤，计数，根据计数结果，进行种子库细胞冻存，冻存规格3-4×106ml管；放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存；5观察P2代种子细胞生长状态，筛选出细胞生长状态良好的P2代种子细胞，良好即为满足如下的观察指标：①细胞形态呈长梭形；②流式细胞仪测定CD29+＞95％、CD44+＞95％、CD73+＞95％、CD90+＞95％、CD105+＞95％、CD34+＜2％、CD45+＜2％、HLA-DR+＜2％；③脐带间充质干细胞体外能够向成脂、成骨、成软骨细胞诱导分化；6微生物检测即需厌氧菌、真菌、支原体检测均为阴性后，复苏种子库细胞，按照2-3×104cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P3代细胞；7培养3-4天，融合度达到80-90％，0.9氯化钠注射液清洗细胞一次，加入胰酶消化液使细胞从培养瓶底部脱落，300-500g离心5-8分钟，去上清，培养基重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，按照2-3×104cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基，放入37℃，5％CO2培养箱中继续培养P4代细胞；8按照步骤7的方法将P4代细胞传代培养至P5代后，按照步骤4的方法进行工作库细胞冻存，冻存规格为1.2×1073ml管；放入医用低温冰箱冷冻，24h后转入液氮罐长期保存；9海藻酸钠凝胶配制：溶胶：在生物安全柜中，将灭菌后的海藻酸钠粉末加入含转子的蓝盖瓶中，再向其中依次加入丙二醇、DMSO、复方电解质注射液，边加边摇匀，盖紧瓶盖，室温避光放置48h使其充分溶胀；溶胀48h后将蓝盖瓶放在磁力搅拌器搅拌，使海藻酸钠粉末充分溶解，室温避光保存，得海藻酸钠凝胶；其中，海藻酸钠：丙二醇：DMSO：复方电解质注射液的比例g：ml：ml：ml为1.5-2.5：10-15：10：75-80；10微生物检测即需厌氧菌、真菌、支原体检测均为阴性后，复苏工作库细胞，按照2-3×104cm2接种量将细胞接种到培养瓶中，补加完全培养基后放入37℃，5％CO2培养箱中培养P6代细胞；11细胞培养3天后，融合度达到80-90％，质量浓度0.9％氯化钠注射液清洗细胞两次后，加入胰酶消化液消化回收细胞，300-500g离心5-8分钟，去上清，使用预先配制好的洗液清洗细胞三次，去上清，以20％人血白蛋白重悬细胞沉淀，过滤，计数，根据计数结果，调整细胞悬液浓度至4.5-9×106ml；其中，洗液成分为：每500ml质量浓度0.9％氯化钠注射液中加入1ml质量浓度20％人血白蛋白；12分别将步骤11制得的细胞悬液与步骤9的海藻酸钠凝胶按体积比1:2灌装至预充式注射器中，颠倒混匀后放入医用低温冰箱冷冻保存，即得用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶；所述步骤9中在溶胶处理前还经过如下灭菌处理：电子精密天平称取海藻酸钠粉末，以铝箔纸包起，取一个250ml蓝盖瓶，向其中加入一个磁力搅拌器转子，另取一个蓝盖瓶，向其中加入丙二醇，将包裹海藻酸钠粉末的铝箔纸和两个蓝盖瓶共同121℃高压灭菌30分钟；所述胰酶消化液为重组胰酶消化液Gibco12569-029；所述步骤12中预充式注射器为5ml预充式注射器；所述步骤1中间充质干细胞来源于脐带；所述间充质干细胞的具体制备步骤如下：经授权获取捐献脐带，取检测合格的优质脐带，合格指标为：采集液需厌氧菌、真菌、支原体检测阴性、脐带长度不低于20厘米、母血HIV、HBV、HCV及梅毒检测阴性，脐带组织用脐带清洗液洗净后剪成2-3mm3组织块均匀平铺于培养瓶或培养皿底部，每瓶不少于180块，补加原代培养基后倒放入37℃、5％CO2培养箱中，3-4小时后翻面，继续培养P0代细胞7-10天；其中，脐带清洗液成分为：硫酸庆大霉素终浓度为80IUml的质量浓度0.9％的氯化钠注射液；所述步骤2中细胞沉淀用完全培养基重悬，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IUml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基；所述步骤3中细胞沉淀用完全培养基重悬，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IUml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基；所述步骤4中细胞沉淀用DF-12培养基重悬；所述步骤7中用完全培养基培养基重悬细胞沉淀，完全培养基为含质量浓度10％胎牛血清、100IUml人表皮细胞生长因子的DF-12培养基；所述原代培养基为：DMEMF12培养基中含有体积分数20-25％胎牛血清、100IUml人表皮细胞生长因子、10IUml硫酸庆大霉素注射液；所述完全培养基为DMEMF12培养基中含有体积分数10-15％胎牛血清、100IUml人表皮细胞生长因子；上述凝胶通过体外直接涂抹于伤处的方式给药，创面均无感染现象，实验大鼠全部存活，均可正常进食，涂抹后2天开始，施用处炎性分泌物减少，4天后创口面积逐渐减小，形成新生表皮，创口愈合趋势明显。

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百度查询： 优赛生命科学发展有限公司 一种用于促进外伤愈合的脐带间充质干细胞外用凝胶、给药方法和应用