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申请/专利权人：宁波大学

摘要：本发明公开了基于DNAzyme的双通道电化学方法及其在铅离子检测中的应用研究，该方法主要设计了一种Pb2+特异性酶Pb‑DNAzyme，并将这种酶通过Au‑S键修饰至金电极表面，当在Pb2+存在的条件下，DNAzyme被激活而将底物链切割成两部分，留在电极表面的那部分DNA片段由于Pb2+嵌入可以形成G4结构，通过结晶紫在G4表面的堆叠可以实现电化学方波伏安检测。另一方面，收集被剪切下的DNA片段，通过碱基互补配对原则可以被设计好的DNA三棱柱结构悬挂端捕获，引发杂交链HCR反应，随后将末端转移酶TdT、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP和三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP等引入电极表面，形成一个巨大的DNA网络结构，能够作为联吡啶钌Ruphen32+的载体进行信号放大，用于电化学发光信号测定。

主权项：1.一种基于DNAzyme的双通道电化学方法，其特征在于，具体步骤如下：1DNA三棱柱的制备将DNA干粉置于离心机中用5000rmp离心15min，然后根据DNA合成报告将其稀释到1μM，合成原则：控制摩尔比DNA3L3∶DNA4Sa∶DNA5Sb＝1∶3∶3，DNA3L3的最终浓度为200nM；采用三步合成所需要的DNA三棱柱纳米结构，上半部分合成步骤如下：将DNA3L3、DNA4Sa和10×TAEMg2+，加入双蒸水至总体积为50μL，混匀，退火；下半部分合成步骤如下：将DNA3L3、DNA5Sb、10×TAEMg2+和TCEP混合，加入双蒸水至总体积为50μL，混匀，退火；DNA三棱柱的组装：按照1∶1的比例混匀上半部分和下半部分溶液，进行退火组装；其中，10×TAEMg2+缓冲溶液组成为：0.4MTris，0.02MEDTA，0.2MHAc以及12.5mMMg2+；2电化学生物传感器的制备A.将金电极在麂皮上依次用粒径0.3μm、0.05μm的三氧化二铝粉末抛光0.5～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用超纯水超声清洗1～5min，然后用N2吹干，记为电极a；B.方波伏安检测通道电极制备：将100μL含有0.3μMDNA2，0.2μMDNA1，50mMNaCl，10mMHEPES混合溶液于37℃下反应1h，取5μL滴于Au上，在4℃下孵育过夜，用蒸馏水缓缓冲洗电极，然后滴上5μL1mMMCH溶液孵育30min用来封闭电极，用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极b；再将5μL0.1μMPb2+注入电极表面反应液，于37℃下反应1.5h，随后收集电极表面溶液用于电化学发光检测通道电极制备，用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极c；取5μL浓度为1mM的结晶紫溶液滴涂于电极c上，室温下静置15min，用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极d；通过方波伏安法对不同浓度的Pb2+进行电化学检测；C.电化学发光检测通道电极制备：取5μL步骤1中制备的DNA三棱柱合成溶液滴涂于电极a’，在4℃下孵育过夜，用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极b’；再将步骤B中Pb2+剪切步骤所收集到的电极表面溶液滴于电极b’上，室温下静置1h，用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极c’；制备100μL含有1μMDNA6H1，1μMDNA7H2，10mMTris-HCl，1mMEDTA，1MNaCl的混合液作为HCR杂交溶液，混合均匀后，取5μL滴涂于电极c’上，37℃下反应2h，用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极d’；将100μL含有0.5mMdATP，0.5mMdTTP，0.5UμLTdT，TdT反应缓冲液，蒸馏水混合均匀后，取5μL滴涂于电极d’上，在37℃下反应2h，用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极e’；取5μL浓度为10mM的Ruphen32+溶液，滴涂于电极e’上，室温下避光反应1h，用蒸馏水缓缓冲洗电极，记为电极f’；通过电化学发光法对不同浓度的Pb2+进行电化学发光检测；其中DNA序列如下：

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