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申请/专利权人：丽水市质量检验检测研究院

摘要：本发明涉及一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒及非诊断性检测方法，试剂盒含有以下特异性引物：上游外引物F3如SEQIDNO.1所示，下游外引物B3如SEQIDNO.2所示，上游内引物FIP如SEQIDNO.3所示，下游内引物BIP如SEQIDNO.4所示，上游环引物LF如SEQIDNO.5所示，下游环引物LB如SEQIDNO.6所示。本发明设计一条特有的LAMP引物对沙门氏菌进行检测，同时结合短时间增菌和MPN计数建立了mini‑MPN‑LAMP沙门氏菌快速定量检测方法；本发明灵敏度高，特异性好，操作简单快速，准确可靠，检测成本低。

主权项：1.一种基于ttr基因的沙门氏菌检测试剂盒的非诊断性检测方法，其特征在于包括下述步骤：（1）制作检测沙门氏菌的环介导等温扩增试剂盒；配制LAMP反应液：LAMP反应体系为：10XThermoPolBuffer2μL，MgSO41.2μL，dNTPMixture2.8μL，50XLAMP荧光染料0.2μL，ROX参比荧光染料0.2μL，10XPrimersMix2μL，Bst2.0WarmStartDNA聚合酶0.8μL，DNA粗提液5μL，加无RNA酶水至20μL；反应条件：65℃保温反应40min，以1min作1个循环检测荧光值，结束后按65～95℃，0.2℃s测定溶解曲线；其中，试剂盒含有以下特异性引物：上游外引物F3如SEQIDNO.1所示，下游外引物B3如SEQIDNO.2所示，上游内引物FIP如SEQIDNO.3所示，下游内引物BIP如SEQIDNO.4所示，上游环引物LF如SEQIDNO.5所示，下游环引物LB如SEQIDNO.6所示；（2）样品制备和DNA提取；（a）样品的前处理：无菌操作称取25g或25ml样品，置于盛有225mLBPW的无菌均质杯或合适容器内，均质2～3min；若样品为液态，不需要均质，振荡混匀；使用BPW增菌液对样品均液进行10倍梯度稀释，取3个浓度，每个浓度分别取1mL至3个离心管，置于36℃增菌5h后分别进行DNA提取；（b）待测样品模板DNA的制备：（b-1）对照标准菌株菌液制备：阳性对照：婴儿沙门氏菌CICC21649；阴性对照：大肠埃希氏菌CICC24188，标准菌株接种于血平板中36℃培养24h进行活化，再接种于BPW培养基中36℃培养16h得到新鲜菌液；（b-2）样品与对照菌株的模板DNA制备：采用快速煮沸法提取核酸：吸取1mL样液于12000rmin离心5min，移去上清液900μL，加入1mL无菌水后混匀再12000rmin离心5min，移去上清液900μL，置于100℃电热板中加热15min，迅速冷却后12000rmin离心1min，移取上清液直接用于LAMP实验；上清即作为模板DNA；（3）进行沙门氏菌的环介导等温扩增反应：按照LAMP反应体系对每个提取样品进行检测，依次确证沙门氏菌阳性管数；LAMP反应体系：10XThermoPolBuffer2μL，MgSO41.2μL，dNTPMixture2.8μL，50XLAMP荧光染料0.2μL，ROX参比荧光染料0.2μL，10XPrimersMix2μL，Bst2.0WarmStartDNA聚合酶0.8μL，DNA粗提液5μL，加无菌水至20μL；反应条件：65℃保温反应40min，以1min作1个循环检测荧光值，结束后按65～95℃，0.2℃s测定溶解曲线；检测反应体系：WarmStartLAMP变色预混液10μL，10XPrimerMix2μL，加水至15μL，反应前加入样品DNA提取液5μL；使用金属浴65℃加热保温40min，观察样品颜色的变化；颜色变黄则表示检出沙门氏菌；（4）沙门氏菌MPN的报告：按照确证的沙门氏菌阳性管数，检索MPN表，报告每g或每mL样品中沙门氏菌的MPN值；试剂盒的理论检出限为3.6CFUmL。

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