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申请/专利权人：湖南农业大学

摘要：本发明公开了草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，包括以下步骤：步骤1：草鱼IL‑10启动子区插入缺失分子标记的鉴定，提取草鱼组织总DNA，于‑80℃保存备用；根据GenBank数据库中已报道的草鱼IL‑10启动子序列，设计一对特异性引物IL‑10PF和IL‑10PR进行PCR扩增；步骤2：草鱼IL‑10启动子区插入缺失分子标记对启动子活性的影响分析；步骤3：草鱼IL‑10启动子区插入缺失分子标记与草鱼出血病抗性的关联分析。本发明在草鱼白介素10启动子区鉴定一处影响启动子活性的插入或缺失变异，该变异可用于白介素10启动子活性研究，并且可作为分子标记用于草鱼抗病选育。

主权项：1.草鱼白介素10启动子区插入或缺失变异的鉴定分析方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：草鱼IL-10启动子区插入缺失分子标记的鉴定，提取草鱼组织总DNA，于-80℃保存备用；根据GenBank数据库中已报道的草鱼IL-10启动子序列，设计一对特异性引物IL-10PF和IL-10PR进行PCR扩增；步骤2：草鱼IL-10启动子区插入缺失分子标记对启动子活性的影响分析，化学合成含“GAGTT”序列重复2次缺失型和“GAGTT”序列重复3次插入型的草鱼IL-10启动子序列并分别连接至pGL3.0Basic载体，获得缺失型pGL3.0-IL-10P0-Luc以及插入型pGL3.0-IL-10P1-LucIL-10启动子的荧光素酶报告基因质粒；将含IL-10启动子的荧光素酶报告基因质粒与海肾荧光素酶质粒共转染至CIK细胞，分析缺失与插入型草鱼IL-10启动子以及pGL3.0Basic空载体的荧光素酶活性，以海肾荧光素酶活性作为参照进行标准化；步骤3：草鱼IL-10启动子区插入缺失分子标记与草鱼出血病抗性的关联分析，以IL-10杂合型草鱼为亲本获得同时含三种IL-10基因型草鱼的全同胞家系子代，在池塘饲养三个月后转移至30℃的循环水养殖系统，暂养7天后使用由本实验室保存的Ⅱ型出血病病毒液浸泡感染草鱼，实验共分为三组，每组150尾草鱼；感染后收集所有感病死亡草鱼的鳍条保存于-20℃，在连续7天无草鱼死亡时收集存活草鱼鳍条，提取所有感染出血病后死亡及存活草鱼鳍条的DNA，利用引物IL-10PF和IL-10PR扩增所有草鱼IL-10启动子区序列并进行测序，分别统计感染出血病后死亡及存活草鱼中三种白介素10基因型草鱼的数量。

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