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申请/专利权人：江苏科技大学

摘要：本发明公开了基于核仁蛋白和胞内microRNA逻辑门控的体系、制备方法和应用，所述方法在基于负载金碳点GCDs的NCL‑AS1411的逻辑门的引导下，人造细胞可以对乳腺癌标志物核仁蛋白NCL以及miRNA‑21进行逻辑响应,该方法可以提高乳腺癌早期检测准确性，避免假阳性。其创新之处在于使用人造细胞模拟乳腺癌细胞，既可以定量检测，又能实现细胞成像。此外，光稳定性好的聚集诱导发光AIE荧光探针和G‑四链体的进一步结合，具有增强荧光信号和稳定G4的特性，这也使得该分析方法对目标NCL的检测具有极高的灵敏度本发明所述方法可以定量NCL和miRNA‑21的浓度，NCL的线性范围为0.005～0.5μgmLR2＝0.99358。miRNA‑21的线性范围为0.1fM‑100pMR2＝0.99938，检出限LOD为24.47aM。

主权项：1.基于核仁蛋白和胞内microRNA逻辑门控体系的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1、合成金碳点GCDs采用微波法合成GCDs，制备新鲜氯金酸溶液，加水稀释至浓度为1-3mM，配制浓度为2-4mM的谷胱甘肽溶液，大力搅拌后二者混合，向混合物中加入葡萄糖，葡萄糖在溶液中的终浓度为0.1-0.5mM，微波炉中加热至出现金黄色固体；加水溶解、离心，取金黄色上清液于煮沸后的透析袋内透析；S2、合成GCDs修饰探针为了将二硫键分解为巯基，将1-5μMssDNA探针与三2-羰基乙基磷盐酸盐TCEP按摩尔浓度比1:1000混合，30℃孵育过夜,用磷酸盐缓冲盐水PBS1-5mM和氯化钠溶液30-50mM稀释GCDs溶液，共孵育30min，然后，向GCDs溶液中加入5-10μLssDNA探针，使用旋转仪在室温下混合2h，得到GCDs修饰的探针DNA-GCDs，其中，DNA-GCDs序列为SEQIDNO.1；向DNA-GCDs溶液中加入等体积的DNA-BHQ溶液，其中，DNA-BHQ序列为SEQIDNO.2，得到DNA双链探针DNA-GCDs-BHQ；S3、合成人造细胞取1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰胆碱DSPC、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺DSPE和胆固醇按摩尔比100:1:100-200:2:75混合，然后加入三氯甲烷，摇晃均匀并倒入离心管，置于37℃水浴锅内加热1h，取出后将三氯甲烷旋转挥发形成一层白色薄膜，加水超声形成均匀人造细胞水溶液，4℃保存备用；S4、合成模拟乳腺癌细胞的人造细胞体系向S3形成的白色薄膜中加入miRNA-21溶液，超声，形成均匀的包裹有miRNA-21的人造细胞水溶液，超滤除去多余miRNA-21，其中，miRNA-21序列为SEQIDNO.4-7；向上述水溶液中加入碳二亚胺EDC37℃水浴孵育15min，再加入N-羟基丁二酰亚胺NHS，混合后加入pH为7的缓冲液活化羧基，最后加入核仁蛋白NCL，和羧基偶联、孵育过夜；S5、构建磁珠MBs上的核酸结构将NCL-AS1411适配体和DNA-GCDs-BHQ在50℃孵育2h，然后向其中加入市售修饰了链霉亲和素的MBs，室温涡旋30min，通过链霉亲和素与生物素的强相互作用耦合，磁选后得到耦合的MBs；其中，AS1411序列为SEQIDNO.3；S6、合成聚集诱导发光材料AIE将4,4-苯并二基二苯甲醛和1,3,3-四甲基-3H-碘化吲哚按质量比1:2-1:4混合，在乙醇溶液中80℃加热回流24h，反应结束后抽滤得到暗红色固体；S7、合成G-四链体G4在Tris-HCl缓冲液和PBS中加入适配体NCL-AS1411，37℃孵育2h以上，制得G4。

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百度查询： 江苏科技大学 基于核仁蛋白和胞内microRNA逻辑门控的体系、制备方法和应用