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申请/专利权人：杭州跃真生物科技有限公司

摘要：本发明属于生物技术领域，具体公开了基于二代测序的微生物16SrRNA基因多区域扩增引物组合及其应用方法，包括P1F～P8F以及P1R～P8R，其中，P1F～P8F为上游引物，P1R～P8R为下游引物，实现短读长序列PE150覆盖16SrRNA基因多个多可变区域。本发明引物组的改进具体体现在1筛选的引物组对于细菌界九个主要的门其综合覆盖率超过90％；2筛选的引物组内各引物在扩增过程中产生的PCR嵌合体读数小于35％；3筛选的引物组内各引物的PCR扩增反应条件相同，并与多样本混合方案相配套；4筛选的引物进行扩增和文库构建后，文库片段大小在450bp左右，使用短读长序列PE150即可覆盖全部序列信息，见摘要附图。基于此，本发明是一种低成本，微量，高通量的多重PCR建库方案，具有覆盖细菌种类多，分辨率高，操作简单，成本较低等特点。

主权项：1.基于二代测序的微生物16SrRNA基因多区域扩增引物组合，其特征在于：包括：P1FACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTAGYGGCGNACGGGTGAGTAA；P1RGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTCYNACTGCTGCCTCCCGTAG；P2FACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNATCCTACGGGAGGCAGCAGT；P2RGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAATCGATTACCGCGGCTGCT；P3FACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNGCCGGATAAYTGGGYDTAAAGNG；P3RGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTATCCGGCAGGGTATCTAATCCT；P4FACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCGAATTGACGGGGRCCCG；P4RGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNACGTCATCCMCACCTTCCTC；P5FACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAACCAGGTAGGATTAGATACCCT；P5RGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNACCTGGTTCCGTCAATTCMTTTGAGTTT；P6FACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTTCCAAGAGTTTGATCMTGGCTCAG；P6RGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNATTACTCACCCGTICGCCRCT；P7FACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNAAGAAGGYAACGAGCGCAACC；P7RGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTTGGCGGGAACGTATTCACC；P8FACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNTGCGGCGTACACACCGC；P8RGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNCGCAACTACCTTGTTACGACTT；其中，P1F～P8F为上游引物，结构为IlluminaTruseq文库序列read1-8N-16Sforward引物，P1R～P8R为下游引物，结构为IlluminaTruseq文库序列read2-8N-16Sreverse引物图2，且上游引物和下游引物等摩尔数混合，8个N为内部barcode，用于区分同一次测序的不同的样本。

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