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申请/专利权人：塔里木大学

摘要：本发明公开罗中链霉菌TRM49605遗传操作体系的构建方法，利用罗中链霉菌TRM49605菌丝体为供体细胞，与受体细胞大肠杆菌进行结合转移，得到接合转移转化子，再对接合子进行纯化与培养。本发明大肠杆菌与罗中链霉菌TRM49605的接合转移作，不依赖于原生质体的形成与再生；可以避开宿主菌的限制性系统障碍；可利用件实现载体高效的从大肠杆菌向链霉菌中转移；用于接合转移的质粒都是穿梭质粒，大肠杆菌中这些质粒能够自主复制，更加方面表达载体的构建和操作。

主权项：1.罗中链霉菌StreptmycesluozhongensisTRM49605遗传操作体系的构建方法，其特征在于，利用在液体培养基中直接获得的罗中链霉菌TRM49605菌丝体为供体细胞，与受体细胞大肠杆菌Escherichiacoli进行结合转移，得到接合子，再对接合子进行纯化与培养；罗中链霉菌TRM49605菌丝体供体细胞的培养：在甘油管中保存的罗中链霉菌TRM49605菌丝体，直接接种于TSB菌丝体生长培养基培养基；在TSB菌丝体生长培养基中：30℃220rpmmin摇床上培养30h；受体细胞大肠杆菌ET12567的培养：挑取大肠杆菌ET12567单菌落，接种于5mL的LB大肠杆菌液体液体培养基，加入氯霉素、安普霉素和卡那霉素混合抗生素溶液，进行培养；其中，氯霉素、安普霉素和卡那霉素混合抗生素溶液的制备方法为：5μL的25mgmL的氯霉素，2.5μL的50mgmL的安普霉素和2.5μL的50mgmL卡那霉素混合，然后在37℃培养12h；供体细胞与受体细胞结合转移方法：将罗中链霉菌TRM49605菌丝体和大肠杆菌菌体先分别用LB大肠杆菌液体培养基洗涤2遍后重悬菌体，按照供体细胞罗中链霉菌TRM49605菌丝体和受体细胞大肠杆菌的数量比为100:1的比例混合，混合后涂布于高氏一号接合转移培养基平板上置于37℃培养箱中培养20h，再加入抗生素液体覆盖，使溶液均匀铺满整个平板，吹干后置于30℃培养箱中培养5-7天；其中，抗生素液体的制备方法为1mL的灭菌ddH2O中添加母液浓度为50mgmL的安普霉素10μL和母液浓度为25mgmL的萘啶酮酸20μL；接合子进行纯化与培养：随机挑取接合子，划线于含安普霉素和萘啶酮酸的高氏一号接合转移培养基上，在培养箱中培养，挑取菌丝，接种于TSB菌丝体生长培养基中培养，用于基因组抽取。

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