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申请/专利权人：卓怡呈

摘要：本发明属于包虫病研究技术领域，具体公开了一种泡状棘球蚴原头节提取筛选方法，包括以下步骤：1分离囊泡组织；2初次过滤；3初步清洗；4二次过滤；5筛选。本方法还进一步通过显微镜观察检测原头节的纯度，伊红染色检测镜下拒染头节数量鉴定原头节活性，体外与肝癌细胞共培养检测成囊率。观察结果显示，本发明通过一种泡状棘球蚴原头节提取筛选方法成功实现了从保种沙鼠体内提取筛选纯度高、活性好的原头节，解决了目前获取原头节杂质多、活性参差不一影响进一步基础实验研究的问题。

主权项：1.一种泡状棘球蚴原头节提取和筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1分离囊泡组织：将感染多房棘球蚴6月以上的长爪沙鼠安乐死，置于75％酒精中浸泡15min灭菌消毒备皮，沥干酒精，固定于无菌泡沫板上暴露腹部皮肤，使用无菌眼科剪逐层打开腹腔，无菌镊子钝性分离囊泡组织于盛有无菌PBS的100mm细胞培养皿中清洗，更换培养皿中PBS直至清洗液清亮为止，剔除宿主组织和血液；无菌PBS配置：475mL双蒸水，加入25mL20×PBS,经高压灭菌锅温度为121.3℃，压力为103.4kPa，处理15-30min，冷却1h后4℃保存，使用前加入100x青霉素链霉素5mL；2初次过滤：将1中分离的囊泡组织用无菌手术剪剪碎，采用玻璃组织匀浆器于0℃-4℃条件下研磨，通过匀浆器的玻璃管与柱塞之间微小缝隙和细微的凹陷咬合产生碾切作用，使囊泡破裂原头节释放，缓慢倒入无菌的不锈钢细胞过滤筛中，筛下放置一100mL编号①烧杯收集滤过物；使用预冷的无菌PBS反复少量多次地加入匀浆器中，将研磨液沿玻璃管嘴倒入细胞过滤筛，细胞过滤筛为100目不锈钢网，细胞过滤筛正向放置于烧杯上使用匀浆器的柱塞底端在筛网中充分搅拌加速过滤进程，余操作同前；3初步清洗：将2中烧杯收集所得物沉降3-5min后，去除上清液，烧杯中见大量白色沉淀及絮状物，转移至无菌的50mL离心管中，加入无菌PBS反复清洗、沉降至上清清亮为止，沉淀物含上层絮状物和下层原头节、钙质小体；4二次过滤：将3中得到的沉淀物倒入无菌200目不锈钢细胞过滤筛，筛下置一100mL编号②的烧杯，杯底见致密的白色沉淀物，显微镜下观察为钙质小体等杂质；然后将细胞过滤筛倒置于编号③的100mL烧杯，细胞过滤筛为200目不锈钢网，反向倒置于烧杯上，使用30mL无菌注射器吸取PBS冲洗细胞过滤筛反面，烧杯③收集纯净的原头节沉淀；去除PBS上清，分装1mL原头节沉淀物置于T25细胞培养瓶中，加入5mL完全培养基，置于细胞培养箱中培养24h；5筛选：将4中的培养瓶沿培养瓶的对角线45°置于置管架旁，瓶口朝向右上方，沉降3-5min后用1mL移液器移除培养基上清，盖上瓶盖，沿着培养瓶长轴缓慢摇晃使沉淀物铺满T25培养瓶的底面b面，竖直放置瓶口朝上待原头节自然沉降10s,保持培养瓶侧壁e面与操作台呈30°-45°倾斜，打开瓶盖，用1mL移液器吸取无菌PBS冲刷培养瓶底面b面至无残余物附着，静置1min,用移液器1mL吸头沿着液体表面小心吸取漂浮物，显微镜下观察为囊皮和活性不好的头节；剩余上清分层，使用移液器吸取部分置于显微镜下观察，发现全部为密集分布的钙质小体，移除钙质小体；按步骤5操作重复5-8次，可筛选出活性好的原头节。

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