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申请/专利权人：梅尔顿(深圳)生物医药技术有限公司

摘要：本发明提供一种重组仙台病毒的构建方法，包括：构建质粒pCAGGS‑NPPL；以仙台病毒逆转录样品为模板扩增SeV‑0102DNA；扩增线性化pUC57‑insert质粒收集pUC‑insertDNA；将SeV‑0102DNA片段和pUC‑insertDNA融合，获得Sev‑full质粒，酶切得到Sev‑full‑Not1；合成pUC57‑A质粒，酶切收集A‑Not1，与Sev‑full‑Not1连接得到Sev‑A质粒；提供293T细胞，加入pCAGGS‑NPPL、Sev‑A和T7‑opt三种质粒，转染得到重组仙台病毒。

主权项：1.一种将PBMC重编程为iPS细胞的方法，其特征在于，接种并培养PBMC细胞，在所述PBMC细胞中加入重组仙台病毒Sev-p53DD-Myc和Sev-KOS，继续培养，将所述PBMC细胞感染并重编程为iPS细胞，所述重组仙台病毒的构建方法包括：提供pCAGGS线性化载体、NP基因、P基因和L基因，将NP基因、P基因和L基因分别与pCAGGS线性化载体融合，构建质粒pCAGGS-NP、pCAGGS-P和pCAGGS-L；以仙台病毒逆转录样品为模板，使用高保真DNA聚合酶PhantaEVO分别采用第一引物对和第二引物对进行PCR扩增，获得仙台基因组SeV-01DNA片段和SeV-02DNA片段；在pUC57-Simple中插入第一序列，获得pUC57-inser质粒，采用EcoRI-HF酶切后获得线性化pUC57-insert质粒；采用第三引物对对线性化pUC57-insert质粒扩增，获得pUC-insertDNA；将SeV-01DNA片段、SeV-02DNA片段和pUC-insertDNA融合，获得Sev-full质粒；在pUC57-Simple中插入表达功能性基团A的第二序列，获得pUC57-A质粒，NotI-HF限制性内切酶酶切后，收集A-Not1酶切片段；使用NotI-HF限制性内切酶对Sev-full质粒酶切处理，收集Sev-full-Not1酶切片段；将A-Not1酶切片段和Sev-full-Not1酶切片段连接，得到Sev-A质粒，所述基因A选自KOS和p53DD-Myc；提供293T细胞，接种、培养；转染前将培养基换液为Opti-MEM培养基，然后加入所述质粒pCAGGS-NP、pCAGGS-P、pCAGGS-L、Sev-A质粒和T7-opt质粒，而后进行增殖培养，得到重组仙台病毒，所述增殖培养采用无血清培养基；所述无血清培养基为添加有重组胰蛋白酶和胎牛血清替代物的高糖DMED培养基；其中，所述重组仙台病毒中的L基因包含Y942H突变；所述第一引物对包括：NP-for：ATGGCCGGGTTGTTGAGCAC；HN_up-rev:TTGGCATCCTCGGGTCCTACA；和所述第二引物对包括：HN_down-for：GTAGGACCCGAGGATGCCAAC；Trailer-rev：TTTAAGAGATATGTATCCTATTAAATTTTCTTGTCTTCTTGTAAG；和所述第三引物对包括：pUC-for：TAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCC；pUC-rev：GTGCTCAACAACCCGGCCATC；所述第一序列为：ACGCGTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTGGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACGGAGTCTAGACTCCGTCACCAAACAAGAGAAAAAACATGTATGGGATATACAATGAAGTTAGACAGGATTTTAGGGTCAAAGTATCCACCCTGAGGAGCAGGTTCCAGACCCTTTGCTTTGCTGCCAAAGTTCACGCGGCCGCAGATCTTCACGATGGCCGGGTTGTTGAGCACGAATTCTAGGATACATATCTCTTAAACTCTTGTCTGGTGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACATTCCGAGGGGACCGTCCCCTCGGTAATGGCGAATGGGACCCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATGGGCCC。

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