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申请/专利权人：南京金域医学检验所有限公司

摘要：本发明属于生物技术领域，特别涉及LRSAM1基因SNP突变位点分型引物及其在冠心病预测中的应用，包含：1）扩增rs3802358位点的引物：上游引物序列5’ATCCTGAAATGTAAGCAAATGACTGT3’；下游引物序列5’GCCAGGATCCAGCCAGGTA3’；2）进行突变位点分型的探针：G型探针序列5’CCACACATACGGCTG3’；A型探针序列5’CCACACATATGGCTG3’。本发明公开了一种新的能够解释中国汉族人群的冠心病遗传基础的与冠心病易感性相关的LRSAM1基因，同时确证了LRSAM1基因上与冠心病易感性密切相关的SNP位点rs3802358，检测精度和灵敏度高。

主权项：1.针对LRSAM1基因rs3802358位点G→ASNP突变的分型检测体系在制备患冠心病危险性评估试剂中的应用，其特征在于，所述分型检测体系包括体外检测冠心病相关基因的试剂盒，所述试剂盒包括LRSAM1基因SNP突变位点分型引物、DNA聚合酶、PCR缓冲液；所述LRSAM1基因SNP突变位点分型引物包括1）扩增rs3802358位点的引物：上游引物序列5’ATCCTGAAATGTAAGCAAATGACTGT3’；下游引物序列5’GCCAGGATCCAGCCAGGTA3’；2）进行突变位点分型的探针：G型探针序列5’CCACACATACGGCTG3’；A型探针序列5’CCACACATATGGCTG3’；所述的G型探针的5’端使用VIC荧光基团修饰，3’端使用MGB修饰；A型探针的5’端使用FAM荧光基团修饰，3’端使用MGB修饰；该SNP突变位点为LRSAM1基因rs3802358位点，突变类型为G→A；该SNP突变位点G等位基因的携带者患冠心病的危险性是A等位基因的携带者患冠心病的危险性的2.44倍；所述试剂盒的PCR扩增体系为：2×Taqmanmastmix10μl；所述上游引物0.4μl；所述下游引物0.4μl；所述G型探针0.2μl；所述A型探针0.2μl；ddH2O4.8μl；模板DNA4μl。

全文数据：LRSAM1基因SNP突变位点分型引物及其在冠心病预测中的应用技术领域本发明属于生物技术领域，特别涉及与冠心病易感性相关的LRSAM1基因上的单核苷酸多态性singlenucleotidepolymorphism，SNP位点，以及用于检测所述SNP位点的相应体外检测试剂，尤其涉及所述SNP位点的核酸亲和配体在制备用于检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性的组合物中的应用。背景技术冠状动脉粥样硬化性心脏病coronaryheartdisease，CHD，简称冠心病，是一种病因复杂的疾病，环境和遗传因素均与冠心病的发生发展有关。在美国及许多发达国家，冠心病位列死亡原因首位。目前，我国冠心病的死亡率也居高不下且呈逐年上升趋势。2015年中国城市居民冠心病死亡率为110.6710万，农村居民为110.9110万，与上一年相比略上升。冠心病的发病率也呈现出地域差异，1987年～1993年我国多省市35～64岁人群调查中国MONICA发现，最高发病率为108.710万山东青岛，最低为3.310万安徽滁州，有较显著的地区差异，北方省市普遍高于南方省市。近年来，对于冠心病的分子学研究也越来越引起重视。自2007年，AnnaHelgadottir和RuthMcpherson同时发现了9p21区域冠心病与冠心病显著关联之后，陆续有50多个冠心病易感位点被发现。但这些位点均为欧美人群的易感位点，与中国人群的相关性尚未验证。我国在2011年发表了第一篇关于中国人群冠心病易感位点的文章，研究证实了一个新的与中国汉族人冠心病相关的易感位点6p24.1rs6903956。2016年，高敏等对欧美人群的5个易感位点与汉族人冠心病的相关性进行了研究，结果表明其中仅有一个与中国汉族冠心病遗传易感性显著相关。我国对于冠心病的分子研究还处于起步阶段，已知用来解释中国汉族人群的冠心病遗传基础的基因及位点的数量较少，为了提高汉族人群冠心病易感性检测、筛查或预测的准确度，从而更容易、更直接、更灵敏且更特异性地检测、筛查或预测汉族人群冠心病易感性，有必要寻找新的与冠心病易感性相关的易感基因和SNP位点。因此，本研究针对中国江苏人群进行冠心病相关基因筛查，得出了一项与冠心病易感性有关的SNP位点突变。发明内容本发明旨在提供一种新的能够解释中国汉族人群的冠心病遗传基础的与冠心病易感性相关的LRSAM1基因，同时确证了LRSAM1基因上与冠心病易感性密切相关的SNP位点rs3802358。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：LRSAM1基因SNP突变位点分型引物，包含：1扩增rs3802358位点的引物：上游引物序列5’ATCCTGAAATGTAAGCAAATGACTGT3’；下游引物序列5’GCCAGGATCCAGCCAGGTA3’；2进行突变位点分型的探针：G型探针序列5’CCACACATACGGCTG3’；A型探针序列5’CCACACATATGGCTG3’。所述的G型探针的5’端使用VIC荧光基团修饰，3’端使用MGB修饰；A型探针的5’端使用FAM荧光基团修饰，3’端使用MGB修饰。一种体外检测冠心病相关基因的试剂盒，该试剂盒包含所述的LRSAM1基因SNP突变位点分型引物。该试剂盒还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液。针对LRSAM1基因rs3802358位点G→ASNP突变的分型检测体系，包括所述的体外检测冠心病相关基因的试剂盒，PCR扩增体系为：2×Taqmanmastmix10μl本发明还公开一种LRSAM1基因SNP突变位点，该SNP突变位点为LRSAM1基因rs3802358位点，突变类型为G→A。本发明还提供LRSAM1基因SNP突变位点分型引物作为检测、预防、诊断或治疗冠心病的试剂的应用。所述的体外检测冠心病相关基因的试剂盒作为检测、预防、诊断或治疗冠心病的试剂的应用。针对LRSAM1基因rs3802358位点G→ASNP突变的分型检测体系作为检测、预防、诊断或治疗冠心病的试剂的应用。用全外显子测序WES方法对样本进行差异SNP筛选。LRSAM1基因SNP分型检测方法：针对LRSAM1基因rs3802358位点G→ASNP突变的分型检测方法：1、采集人外周血2ml，EDTA抗凝，-80℃保存。2、设计上下游引物一对：上游引物序列ATCCTGAAATGTAAGCAAATGACTGT；下游引物序列GCCAGGATCCAGCCAGGTA；3、设计分型探针：G型探针序列CCACACATACGGCTG，5’端使用VIC荧光基团修饰，3’端使用MGB修饰；A型探针序列CCACACATATGGCTG，5’端使用FAM荧光基团修饰，3’端使用MGB修饰。4、提取外周血基因组DNA，采用TaqmanPCR法进行分型检测。采用TaqmanPCR法进行分型检测时，采用的扩增体系：其中探针FAM为A型探针，探针VIC为G型探针，2×Taqmanmastmix为PCR缓冲液，模板DNA为提取的外周血基因组DNA。扩增荧光结果：1.当只有VIC荧光信号扩增曲线时，表示rs3802358位点的等位基因为GG纯合子；当只有FAM荧光信号扩增曲线时，表示rs3802358位点的等位基因为AA纯合子；当同时出现VIC和FAM两种荧光信号扩增曲线时，表示rs3802358位点的等位基因为AG杂合子。本发明公开了一种新的能够解释中国汉族人群的冠心病遗传基础的与冠心病易感性相关的LRSAM1基因，同时确证了LRSAM1基因上与冠心病易感性密切相关的SNP位点rs3802358，检测精度和灵敏度高。附图说明图1为本发明的GG纯合子扩增曲线示意图；图2为本发明的AA纯合子扩增曲线示意图；图3为本发明的AG杂合子扩增曲线示意图。具体实施方式为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明，实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。除非特别说明，制备过程在常温、常压状态下进行；除非特别说明，本发明中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，本发明中采用的试验条件为本技术领域常规试验条件；除非特别说明，本发明中所用试剂均为市购；除非特别说明，本发明中的水为去离子水。实施例1，一种冠心病易感基因即LRSAM1基因。含有LRSAM1的基因的待测样品可以从来自试验者的血液获得。实施例2，一种体外检测冠心病相关基因的试剂，该试剂用于检测LRSAM1基因rs3802358位点的SNP基因型，该试剂包括如下引物及探针:上游引物序列5’ATCCTGAAATGTAAGCAAATGACTGT3’SEQIDNo.1；下游引物序列5’GCCAGGATCCAGCCAGGTA3’SEQIDNo.2；G型探针序列5’VIC-CCACACATACGGCTG-MGB3’SEQIDNo.3；A型探针序列5’FAM-CCACACATATGGCTG-MGB3’SEQIDNo.4。所谓SNP即单核苷酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。部分SNP会直接影响到蛋白质结构或基因表达水平，本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。冠心病是一种病因复杂的疾病，除了遗传物质的作用之外，患病者所属人种、生活环境及生活习惯等也与冠心病的发生息息相关。对该疾病的发生起作用的因素中，起作用的基因总数估计多达上百条，各个基因之间又存在着相互作用，基因又和环境之间存在相互作用。冠心病心肌梗死的发生具有一定的家族聚集性，但更多的是一些散发病例。本发明首先采用外显子组测序WES，筛选出冠心病患者与健康人之间与冠心病可能相关的SNP；再用病例-对照关联分析，通过大样本的验证实验，证实这些SNP与冠心病之间的关系。所述病例对照分析就是在采用随机挑选的两组人群中病例和对照比较某等位基因的频率。本发明在江苏省汉族人群中通过统计分析135例冠心病患者和40例对照，经过大量的实验，最后以确凿的证据证明了具有本发明的rs3802358多态性位点的LRSAM1基因为冠心病相关基因。实施例3，一种有体外检测冠心病相关基因的试剂的制剂或试剂盒，其特征在于该试剂盒包含PCR扩增酶即DNA聚合酶及相应缓冲液。本发明检测rs3802358位点多态性的冠心病相关基因的试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性；rs3802358位点突变的冠心病相关基因的试剂盒可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病；体外检测冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。实施例4，一种体外检测冠心病相关基因的试剂在制备用于体外检测冠心病相关基因的制剂或试剂盒中的应用。本发明检测rs3802358位点多态性的冠心病相关基因的试剂盒可以用于体外检测冠心病相关基因的多态性；rs3802358位点突变的冠心病相关基因的试剂盒可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病；体外检测冠心病相关基因的方法可以用于检测、预防、诊断或治疗冠心病。实施例5，与上述实施例的不同之处在于，试剂盒还包含PCR扩增引物及探针。实施例6，筛查实验。采用全外显子测序法WES进行两组人群差异基因的筛选。研究对象的选择：冠心病组5例，选自2016年12月在南京市第一医院心血管病研究所就诊的冠心病患者，所有冠心病患者符合2007年冠心病诊断与治疗指南；对照组5例，选自2016年12月在南京市第一医院进行体检的健康人。两组年龄、性别构成无统计学差异P0.05。所有冠心病患者和健康对照者均为无血缘关系的江苏地区汉族人群，排除其他心脏疾病及肝脏、肾脏疾病。方法：使用QIAGEN试剂盒进行WES测序，DNA提取具体操作步骤参照QIAamp-DNA-FFPE-Tissue-Handbook--June-2012-EN.pdf和DNeasy-Blood--Tissue-Handbook.pdf文件。用酶标仪测定DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳检查DNA的完整程度。用AgilentSureSelectAllHumanExomelibrary50、58、78MbV5、V6、V5+UTR全外显子捕获试剂盒进行测序文库构建，详细流程参看文件：G7530-90000-agilentWES.pdf。将待测DNA文库浓度在cBot上完成clustergeneration，然后将Flowcell转移到测序系统上，按照Illumina的标准流程进行二代测序及数据分析。结果：根据变异位点在不同样本中的基因型差异，利用Fisher精确检验，找到casecontrol组间差异的突变位点，差异的P值越小，说明变异位点在两组间差异越显著，筛选条件：P0.05。再以冠心病组突变样本率为1和对照组突变样本率为0为筛选条件，最终筛选出LRSAM1基因，进行后续验证。实施例7，验证实验。采用Taqman-PCR方法检测本发明的冠心病基因LRSAM1多态位点rs3802358在患病者和正常人群中的差异。研究对象的选择：冠心病组135例，选自2017年11月-2018年1月在南京市第一医院心血管病研究所就诊的冠心病患者，所有冠心病患者符合2007年冠心病诊断与治疗指南；对照组40例，选自2017年11月-2018年1月在南京市第一医院进行体检的健康人。两组年龄、性别构成无统计学差异P0.05。所有冠心病患者和健康对照者均为无血缘关系的江苏地区汉族人群，排除其他心脏疾病及肝脏、肾脏疾病。方法：PCR反应体系20μL：基因组模板4μL来自外周血，使用Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒进行提取，2×Taqmanmastmix10μL，上游、下游引物各0.4μL，FAM探针0.2μL，VIC探针0.2μL，ddH2O4.8μL，在ABI7500实时荧光PCR仪上进行PCR反应，PCR循环参数：94℃预变性3分钟；经94℃5秒，60℃30秒循环40周。引物和探针序列如下：上游引物序列5’ATCCTGAAATGTAAGCAAATGACTGT3’；下游引物序列5’GCCAGGATCCAGCCAGGTA3’；G型探针序列5’VIC-CCACACATACGGCTG-MGB3’；A型探针序列5’FAM-CCACACATATGGCTG-MGB3’。结果：当只有VIC荧光信号扩增曲线时，表示rs3802358位点的等位基因为GG纯合子；当只有FAM荧光信号扩增曲线时，表示rs3802358位点的等位基因为AA纯合子；当同时出现VIC和FAM两种荧光信号扩增曲线时，表示rs3802358位点的等位基因为AG杂合子。结果如下图1-3所示。实施例8，为进一步从遗传的角度探讨LRSAM1基因和冠心病发病之间的关系，并为国内外已有的同类研究提供遗传流行病学的证据，运用Taqman实时荧光PCR方法，在收集到的冠心病患者和对照组人群中，体外检测来自待测个体的样品中rs3802358位点的多态性，从而分析rs3802358位点在冠心病患者和正常对照人群的分布差异。首先运用Hardy-Weinberg平衡检验。Hardy-Weinberg平衡是一种群体遗传学的概念：主要是指一民族生活在某一地区、能相互随机杂交的一群人体，这个群体所具有的全部遗传信息称为该群体的基因库，它直接反映本地区，本民族的遗传特征。这些遗传信息的表达形式基因频率和基因型频率，在没有突变、迁移和遗传漂变的条件下，群体中基因频率和基因型频率遵守保持不变即为Hardy-Weinberg平衡。这样既有遗传多态性，又具备遗传的稳定性。对基因分型结果分析发现，基因分型结果符合Hardy-Weinberg平衡，因此可以排除实验误差，该基因分型结果比较可靠，分析结果见表1。表1结论：单因素分析发现，多态位点rs3802358的三种基因型个体在病例组和对照组中的分布有明显差异P0.05，AG显隐性遗传模式进一步分析发现，A等位基因的携带者相对G等位基因的携带者在病例组和对照组中有显著差别P0.05，其中A等位基因的携带者患冠心病的危险性是G等位基因的携带者患冠心病的危险性的2.44倍。实施例9，体外检测冠心病相关基因即LRSAM1基因的试剂盒一种体外检测冠心病相关基因的试剂盒，该试剂盒包含：1扩增rs3802358位点的引物：上游引物序列5’ATCCTGAAATGTAAGCAAATGACTGT3’；下游引物序列5’GCCAGGATCCAGCCAGGTA3’；2进行突变位点分型的探针：G型探针序列5’VIC-CCACACATACGGCTG-MGB3’；A型探针序列5’FAM-CCACACATATGGCTG-MGB3’。3PCR扩增酶及相应缓冲液。以上显示描述了本发明的基本原理、主要特征以及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落进要求保护本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。序列表110南京金域医学检验所有限公司120LRSAM1基因SNP突变位点分型引物及其在冠心病预测中的应用130xhx20180831021412018-08-311604170SIPOSequenceListing1.0210121126212DNA213Homosapiens4001atcctgaaatgtaagcaaatgactgt26210221119212DNA213Homosapiens4002gccaggatccagccaggta19210321115212DNA213Homosapiens4003ccacacatacggctg15210421115212DNA213Homosapiens4004ccacacatatggctg15

权利要求：1.LRSAM1基因SNP突变位点分型引物，其特征在于，包含：1）扩增rs3802358位点的引物：上游引物序列5’ATCCTGAAATGTAAGCAAATGACTGT3’；下游引物序列5’GCCAGGATCCAGCCAGGTA3’；进行突变位点分型的探针：G型探针序列5’CCACACATACGGCTG3’；A型探针序列5’CCACACATATGGCTG3’。2.根据权利要求1所述的LRSAM1基因SNP突变位点分型引物，其特征在于，所述的G型探针的5’端使用VIC荧光基团修饰，3’端使用MGB修饰；A型探针的5’端使用FAM荧光基团修饰，3’端使用MGB修饰。3.一种体外检测冠心病相关基因的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的LRSAM1基因SNP突变位点分型引物。4.根据权利要求3所述的一种体外检测冠心病相关基因的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括DNA聚合酶、PCR缓冲液。5.针对LRSAM1基因rs3802358位点G→ASNP突变的分型检测体系，其特征在于，包括权利要求3或4所述的体外检测冠心病相关基因的试剂盒，PCR扩增体系为：2×Taqmanmastmix10μl上游引物0.4μl下游引物0.4μlG型探针0.2μlA型探针0.2μlddH2O4.8μl模板DNA4μl。6.LRSAM1基因SNP突变位点，其特征在于，该SNP突变位点为LRSAM1基因rs3802358位点，突变类型为G→A。7.权利要求1或2所述的LRSAM1基因SNP突变位点分型引物作为检测、预防、诊断或治疗冠心病的试剂的应用。8.权利要求3或4所述的体外检测冠心病相关基因的试剂盒作为检测、预防、诊断或治疗冠心病的试剂的应用。9.权利要求5所述的针对LRSAM1基因rs3802358位点G→ASNP突变的分型检测体系作为检测、预防、诊断或治疗冠心病的试剂的应用。

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