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申请/专利权人：石家庄中天生物技术有限责任公司;河北鲲翔济世医药科技有限公司

摘要：本发明提供了一种高纯度环孢菌素衍生物STG‑175的制备方法，包括以下步骤：将含有STG‑175及其异构体的反应混合液减压浓缩去溶剂，得反应混合物；向反应混合物中加入羟基保护剂对3位侧链上的羟基进行保护，得STG‑175及其异构体的衍生物反应液，将所得衍生物反应液浓缩后通过硅胶柱层析分离，得到STG‑175衍生物；将所得STG‑175衍生物在水解剂中脱保护，再经浓缩、提取、洗涤、结晶，即得到STG‑175成品。本发明的制备方法可大大减少C18硅胶层析分离精制次数，只需一次分离，就能将STG‑175与其异构体分离开，所制得的STG‑175产品的纯度可达到99.51%，且产品收率高，可达53%左右，本发明方法可大量制备高纯度STG‑175产品，是现有制备方法无法企及的。

主权项：1.一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有STG-175及其异构体的反应混合液减压浓缩去溶剂，得反应混合物；向反应混合物中加入羟基保护剂对3位侧链上的羟基进行保护，得STG-175及其异构体的衍生物反应液，将所得衍生物反应液浓缩后通过硅胶柱层析分离，得到STG-175衍生物；将所得STG-175衍生物在水解剂中脱保护，再经浓缩、提取、洗涤、结晶，即得到STG-175成品；所述羟基保护剂是一氯乙酸酐、二氯乙酸酐、三氯乙酸酐或二苯基磷酰氯中的任意一种或几种。

全文数据：一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法技术领域本发明涉及一种新型抗丙肝病毒药物的制备方法，具体涉及一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法。背景技术丙型病毒性肝炎，简称为丙型肝炎、丙肝，是一种由丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV）感染引起的病毒性肝炎，据世界卫生组织统计，目前全球HCV的感染率约为3%，估计约1.8亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约为3.5万例。丙型肝炎呈全球性流行，可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至细胞癌（HCC）。有数据显示，未来20年内由HCV感染导致的死亡率将持续增长，HCV感染已成为严重的社会公共卫生问题。目前，HCV感染的治疗方法主要有两种，一种是连续6到12个月静脉注射α-干扰素（IFN-α），另一种是利用IFN-α和通用型抗病毒核苷模拟物（如利巴韦林）进行共同治疗。上述两种方法的治疗功效低，且所用干扰素的副作用较大，因此，需要研发用于治疗HCV感染的有效抗病毒剂，环孢菌素衍生物STG-175即是一种对HCV细胞具有很好的清除效果的新型抗丙肝病毒在研药物。环孢菌素衍生物STG-175，即[S-4-羟基丁基硫基-甲基-肌氨酸]-3-[γ-羟基-N-甲基亮氨酸]-4-环孢菌素，其结构式为：。WO2014145686中公开了STG-175的制备方法，其先以4-羟基环孢菌素为原料制得3-亚甲基-4羟基环孢菌素，再将3-亚甲基-4羟基环孢菌素与4-巯基-1-丁醇或巯基丁酸甲酯通过1,4加成反应制备STG-175。当采用4-巯基-1-丁醇与3-亚甲基-4-羟基环孢菌素反应时，所得的产品中含有STG-175异构体（简称206），该异构体与STG-175的物化性质极其相似，TLCRf值非常接近，经过两次展开的Rf值分别是0.25和0.2，HPLC分析STG-175及其异构体，保留时间分别是24.72min和20.71min。因此，两者的分离难度非常之大，即使经过多次硅胶柱分离仍然得不到高纯度的STG-175产品，且操作繁杂，收率较低，不适合大量样品的制备。反应过程如下所示：。当采用巯基丁酸甲酯与3-亚甲基-4羟基环孢菌素反应时，同样也会得到物化性质非常接近的两个异构体，而且还需要将酯基还原成醇才能得到STG-175产品，还原收率较低，也不适合大量样品的制备。反应过程如下：。综上所述，现有制备STG-175的方法均存在收率低、纯度低、操作繁琐的问题，如何提高产品纯度，提高药效，减少杂质的副作用，是保障患者健康的重中之重，也是SFDA和美国FDA对新药质量的基本要求。发明内容本发明的目的就是提供一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，以解决现有制备方法收率低、纯度低、操作繁琐的问题。本发明的目的是这样实现的，一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，包括以下步骤：将含有STG-175及其异构体的反应混合液减压浓缩去溶剂，得反应混合物；向反应混合物中加入羟基保护剂对3位侧链上的羟基进行保护，得STG-175及其异构体的衍生物反应液，将所得衍生物反应液浓缩后通过硅胶柱层析分离，得到STG-175衍生物；将所得STG-175衍生物在水解剂中脱保护，再经浓缩、提取、洗涤、结晶，即得到STG-175成品。进一步地，本发明的具体步骤为：a.3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与4-巯基-1-丁醇反应得到STG-175及其异构体的反应混合液，将反应混合液减压浓缩去溶剂，得反应混合物；b.将所得反应混合物溶于有机溶剂中，于-5~50℃下滴加羟基保护剂进行保护反应，待反应完毕，得到STG-175及其异构体的衍生物反应液；c.将所得衍生物反应液浓缩，得粘稠物，将该粘稠物用C18硅胶层析分离，并将洗脱液减压浓缩，得STG-175衍生物；d.将所得STG-175衍生物溶解于有机溶剂中，于-5~50℃下滴加水解剂进行脱保护反应，待反应完毕，得水解反应液；e.将所得水解反应液减压浓缩，蒸去溶剂后，加入提取剂，搅拌，静置，分去水相，再依次用饱和盐水、纯水洗涤，将有机相减压浓缩至干，即得到STG-175成品。所述步骤b中的羟基保护剂是一氯乙酸酐、二氯乙酸酐、三氯乙酸酐或二苯基磷酰氯中的任意一种或几种。所述步骤b中所用有机溶剂为烷烃类溶剂，具体为二氯甲烷、三氯甲烷或1,2-二氯乙烷中的任意一种或几种；保护反应的温度为0~5℃；反应过程中产生的盐酸采用有机碱中和，所述有机碱为吡啶、三乙醇胺或二异丙胺中的任意一种或几种。所述步骤b中有机溶剂和羟基保护剂的用量以步骤a中3-亚甲基-4-羟基环孢菌素的用量来确定，其中3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与羟基保护剂的摩尔比为1∶1.5~6，优选1∶2.5，3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与溶剂的质量体积比为1g∶5~20mL，优选1g∶10mL。所述步骤d中所用有机溶剂为醇类溶剂，具体为甲醇、异丙醇、乙醇或甲醇二氯甲烷混合溶剂中的任意一种或几种；脱保护反应的温度为5~10℃。所述步骤d中有机溶剂和水解剂的用量以步骤a中3-亚甲基-4-羟基环孢菌素的用量来确定，其中，3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与水解剂的摩尔比为1∶3~8，优选为1∶3.5，3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与有机溶剂的质量体积比为1g∶5~20mL，优选1g∶10~12.5mL，更优选为1g∶12.5mL。所述步骤d中的水解剂是氨水3N~5N或氢氧化钠（5N~8N）水溶液。所述步骤e中的提取剂为乙酸乙酯、叔丁基甲基醚或二氯甲烷中的任意一种或几种。与现有技术相比，本发明的制备方法可大大减少C18硅胶层析分离精制次数，只需一次分离，就能将STG-175与其异构体分离开，所制得的STG-175产品的纯度可达到99.51%，且产品收率高（可达53%左右，远高于现有技术的21%），损失少，本发明方法可大量制备高纯度STG-175产品，是现有制备方法无法企及的。另外，由于本发明方法所制得的产品的纯度高，产品的药效也相应提高，杂质含量减少，杂质带来的副作用也相应减小，从而为患者的健康提供了更加安全可靠的保障。附图说明图1是4-羟基-环孢菌素的HPLC图谱。图2是合成的3-亚甲基-4-羟基环孢菌素的HPLC图谱。图3是STG-175及其异构体的反应混合液的HPLC图谱。图4是羟基保护反应得到的衍生物反应液的HPLC图谱。图5是分离出的STG-175氯乙酸酯的衍生物的质谱图。图6是所得STG-175成品的HPLC图谱。图7是对比例1所制备的STG-175产品的HPLC图谱。具体实施方式下面结合具体实施例进一步阐述本发明，在以下各实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂为市售分析纯或化学纯。以下各实施例中，无特别说明的STG-175及其异构体的反应混合物均按以下方法制备：氮气保护下，将四氢呋喃150ml及二异丙胺15.39m加入到500ml四口反应瓶中，降温至-78℃后，开始滴加正丁基锂（2.2M，49.3mL）的四氢呋喃溶液150mL，滴加完毕，搅拌1h。此温度下，滴加预先配制好的含12.31g4-羟基-环孢菌素（HPLC纯度：97.04，见图1）的四氢呋喃溶液30mL，滴加完毕继续搅拌2h后，往该反应液中通二氧化碳气体，通气时间为2h，接着保温1h后，自然升至室温。将该反应液冷却至0~5℃，滴加氯甲酸氯甲酯13.98g，然后自然升温至室温过夜。加30mL水终止反应后，减压浓缩出四氢呋喃，加乙酸乙酯100mL，水80mL，搅拌30min提取，乙酸乙酯提取液浓缩后，用硅胶柱层析分离得3-亚甲基-4-羟基环孢菌素，得量5.52g，HPLC纯度：97.12%（见图2）（HPLC分析条件：柱：Agilentporoshell120SB-C182.7µm4.6mm×150mm；柱温：80℃；流动相：乙腈水叔丁基甲醚=35057080；流速：1.0ml分；检测波长：254nm）。将3-亚甲基-4-羟环孢素（2.13g，0.0017mol）、甲醇25mL、4-巯基1-丁醇（1.56g，0.0147mol）、氢氧化锂（0.94g，0.039mol）一并投入到500mL反应瓶中，按照WO2014145686A2实例89方法2操作，液相检测反应完毕后（见图3，HPLC分析条件：C18柱，乙腈水醋酸PH=4，210nm，柱温64℃，异构体和STG-175出峰时间分别为20.71min和24.72min），在30~35℃下，减压浓缩出甲醇，得反应浓缩物物2.43g。反应式为：。实施例1羟基保护反应：向STG-175及其异构体的反应混合物中加入二氯甲烷20mL搅拌溶解后，加入吡啶0.34g（0.00425mol），降温至0~5℃，开始滴加氯乙酸酐0.73g0.00425mol，滴加完毕，此温度下保温30min，HPLC检测反应完毕（见图4，异构体和STG-175两个衍生物出峰时间分别为48.28min和69.81min），得衍生物反应液。分离：将上述衍生物反应液浓缩至干，得粘稠状残留物，该残留物用C18硅胶层析分离得含高纯度的STG-175的洗脱液，洗脱液减压浓缩，得高纯度STG-175氯乙酸酯的衍生物1.39g，对其进行质谱分析，质谱图如图5所示。脱保护反应：将上述得到的STG-175衍生物溶解在15mL甲醇中，降温至10~15℃，滴加NH3.H2O（3N，1.1mL），滴加完毕保温10min，反应完毕，得水解反应液。后处理：水解液减压浓缩，蒸出甲醇后，加入15mL乙酸乙酯，搅拌30min，静置20min分去水相，再分别用饱和盐水10mL、纯水10mL洗涤，取有机相，有机相减压浓缩至干，得高纯度STG-175产品1.21g，收率52.38%，纯度99.51%，HPLC图谱见图6。反应式为：实施例2将羟基保护反应中的0.34g吡啶改为0.43g三乙胺，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.18g，摩尔收率为51.1%（以3-亚甲基-4-羟环孢素计），纯度为99.5%。以下收率均以3-亚甲基-4-羟环孢素为原料计的摩尔收率。实施例3将羟基保护反应中的0.34g吡啶改为0.43g二异丙胺，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.16g，收率为50.22%，纯度为99.5%。实施例4将脱保护反应中的NH3.H2O（3N，1.1mL）改为NaOH（7N，0.47mL），其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.05g，收率为45.45%，纯度为99.5%。实施例5将后处理过程中的20mL乙酸乙酯改为15mL甲基叔丁基醚，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.22g，收率为52.81%，纯度为99.5%。实施例6将羟基保护反应中的氯乙酸酐0.73g改为1.02g二氯乙酸酐，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.09g，收率为40.37%，纯度为99.51%。实施例7将羟基保护反应中的氯乙酸酐0.73g改为1.31g三氯乙酸酐，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.12g，收率为41.17%，纯度为99.5%。实施例8将羟基保护反应中的0.73g氯乙酸酐改为1g二苯基磷酰氯，其他条件及操作均同实施例1，得高纯度STG-175产品1.14g，收率为41.91%，纯度为99.66%。实施例9制备STG-175粗品反应：氮气保护下，将3-亚甲基-4-羟环孢素12.31g（摩尔数0.01mol）,甲醇125ml，4-巯基-1-丁醇1.69g（0.015mol）,氢氧化锂0.72g（0.03mol）一并投入到500ml的反应瓶中，在20~25℃间反应24小时，液相检测反应完毕后，加入柠檬酸1.92g（0.01mol）,中和后，加压蒸出甲醇，得浓缩物，浓缩物加乙酸乙酯120ml溶解后，用去离子水100ml×2洗涤两次，有机相用无水硫酸镁干燥1小时，过滤出干燥剂，有机相减压浓缩至干得浓缩物14.23g。保护反应：氮气保护下，将上述浓缩物用145ml二氯甲烷溶解，加入吡啶2.0g（0.025mol）后，降温至0~5℃，滴加氯代乙酸酐4.27g（0.025mol），滴加完毕保温30分钟，HPLC检测完毕后，将反应液浓缩至干。层析柱分离：该残留物用C18硅胶层析纯化分离得含高纯度的STG-175氯代乙酸酯的洗脱液，洗脱液减压浓缩至干，得高纯度STG-175氯乙酸酯的衍生物的浓缩物7.91g。脱保护反应：将上述得到的高纯度衍生物7.91g0.056mol用甲醇80ml溶解后，降温至10~15℃间，滴加3N-氨水（6.5ml）滴加完毕保持10分钟，水解完毕。将反应液的甲醇蒸出后，加二氯甲烷溶解，用去离子水洗涤3次，有机相用无水硫酸钠干燥6小时后，除干燥剂过滤，滤液浓缩至干得高纯度STG-175产品6.95g，收率52.1%，纯度99.5%对比例1将实施例1所用的STG-175及其异构体的反应混合物直接进行C18硅胶柱层析分离，经过5次C18硅胶柱层析分离后，最终得到STG-175产品0.49g，收率为21.46%，纯度为96.18%，HPLC图谱见图7。对比例2按照WO2014145686实施例88和实施例89的方法1制备STG-175产品，具体步骤为：将溶于3-亚甲基-4-羟环孢素1.28g和4-巯基-1-丁酸甲酯0.84g的甲醇25mL溶液中，加入氢氧化锂0.15g,室温反应过夜后得S-3-巯基1-丁酸甲酯-4-羟基环孢菌素和其异构体R--3-巯基1-丁酸甲酯-4-羟基环孢菌素两种化合物反应液。反应液溶剂浓缩后，分别加入乙酸乙酯和食盐水各30mL,提取收集有机相，有机相用饱和盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤掉干燥剂后溶剂浓缩的含有两种异构体的浓缩液，浓缩液经液相制备得S-3-巯基1-丁酸甲酯-4-羟基环孢菌素300mg。收率：21.12%。将氯化铯200mg和硼氢化钠300mg加入到溶于S-3-巯基1-丁酸甲酯-4-羟基环孢菌素200mg的四氢呋喃15mL的溶解液中，然后30min内，将甲醇30mL滴加至该反应液中，并在室温下保温30min，反应完毕，减压浓缩。然后分别加入乙酸乙酯30mL溶解残留物，接着加水30mL洗涤，取有机相，用30mL食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，除去干燥剂，减压浓缩掉乙酸乙酯得浓缩物。浓缩物用硅胶柱层析分离（二氯甲烷甲醇=1000至964）C8柱，乙腈水（0.05%三氟醋酸），检测波长210nm,柱温：64℃得STG-175产品13mg，产率为6.6%，纯度为98.89%。

权利要求：1.一种高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有STG-175及其异构体的反应混合液减压浓缩去溶剂，得反应混合物；向反应混合物中加入羟基保护剂对3位侧链上的羟基进行保护，得STG-175及其异构体的衍生物反应液，将所得衍生物反应液浓缩后通过硅胶柱层析分离，得到STG-175衍生物；将所得STG-175衍生物在水解剂中脱保护，再经浓缩、提取、洗涤、结晶，即得到STG-175成品；所述羟基保护剂是一氯乙酸酐、二氯乙酸酐、三氯乙酸酐或二苯基磷酰氯中的任意一种或几种。2.根据权利要求1所述的高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与4-巯基-1-丁醇反应得到STG-175及其异构体的反应混合液，将反应混合液减压浓缩去溶剂，得反应混合物；b.将所得反应混合物溶于有机溶剂中，于-5~50℃下滴加羟基保护剂进行保护反应，待反应完毕，得到STG-175及其异构体的衍生物反应液；c.将所得衍生物反应液浓缩，得粘稠物，将该粘稠物用C18硅胶层析分离，并将洗脱液减压浓缩，得STG-175衍生物；d.将所得STG-175衍生物溶解于有机溶剂中，于-5~50℃下滴加水解剂进行脱保护反应，待反应完毕，得水解反应液；e.将所得水解反应液减压浓缩，蒸去溶剂后，加入提取剂，搅拌，静置，分去水相，再依次用饱和盐水、纯水洗涤，将有机相减压浓缩至干，即得到STG-175成品。3.根据权利要求2所述的高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，所述步骤b中所用有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷或1,2-二氯乙烷中的任意一种或几种；保护反应的温度为0~5℃。4.根据权利要求2所述的高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，所述步骤b中有机溶剂和羟基保护剂的用量以步骤a中3-亚甲基-4-羟基环孢菌素的用量来确定，其中3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与羟基保护剂的摩尔比为1∶1.5~6，3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与有机溶剂的质量体积比为1g:5~20mL。5.根据权利要求2所述的高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，所述步骤d中所用有机溶剂为甲醇、异丙醇、乙醇或甲醇二氯甲烷混合溶剂中的任意一种或几种；脱保护反应的温度为5~10℃。6.根据权利要求2所述的高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，所述步骤d中有机溶剂和水解剂的用量以步骤a中3-亚甲基-4-羟基环孢菌素的用量来确定，其中，3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与水解剂的摩尔比为1∶3~8，3-亚甲基-4-羟基环孢菌素与有机溶剂的质量体积比为1g∶5~20mL。7.根据权利要求2所述的高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，所述步骤d中的水解剂是氨水或氢氧化钠水溶液。8.根据权利要求2所述的高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，所述步骤e中的提取剂为乙酸乙酯、叔丁基甲基醚或二氯甲烷中的任意一种或几种。9.根据权利要求2所述的高纯度环孢菌素衍生物STG-175的制备方法，其特征在于，所述步骤b中，反应产生的盐酸采用有机碱中和，所述有机碱为吡啶、三乙醇胺或二异丙胺中的任意一种或几种。

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