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申请/专利权人：中国科学院上海生命科学研究院

摘要：本发明涉及控制植物粒数和粒重的GSN1基因、编码蛋白及其应用，具体地，本发明提供一种物质的用途，所述物质为GSN1基因或其编码蛋白、或其突变蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控植物的性状或用于制备调控植物的性状的组合物，所述性状包括选自下组的一种或多种性状：i粒型；ii穗粒数；iii结实率。本发明还首次发现，通过调节所述植物中GSN1蛋白的表达量和或活性，可改良植物性状。

主权项：1.一种物质的用途，所述物质为GSN1基因或其编码蛋白、或其突变蛋白、或其促进剂或抑制剂，其特征在于，用于调控植物的性状或用于制备调控植物的性状的组合物，所述性状包括选自下组的一种或多种性状：i粒型；ii穗粒数；iii结实率。

全文数据：控制植物粒数和粒重的GSN1基因、编码蛋白及其应用技术领域本发明涉及农学领域，具体地，本发明涉及控制植物粒数和粒重的GSN1基因、编码蛋白及其应用。背景技术随着世界范围内人口数量的不断增长以及全球生态环境的逐渐恶化，粮食短缺已经成为一个日益严重的世界性问题，预计到2050年全球人口将达到90亿，这要求世界粮食作物的产量要大幅度提升。因此，传统遗传育种的方法已经不能满足这一需求，利用现代分子遗传学的理论方法深入研究作物产量形成的分子机理可以帮助我们最大程度地提高作物的产量，从而满足人口增长的迫切需要。水稻是世界上最重要的粮食作物之一，而且也已经被发展成植物科学研究中重要的模式植物。水稻种子的每穗粒数和粒重性状是决定水稻产量的三个主要因素即每株有效穗数、每穗粒数和粒重中的两个要素，而粒重是由水稻种子的粒长、粒宽和粒厚决定的。一般来说，增多水稻每穗粒数会使得其千粒重下降，相反，提高水稻的千粒重通常又使得水稻的每穗粒数减少。每穗粒数和粒重虽然都是碳物质库，但是在发育过程中存在着对源的竞争，使得两个性状之间相互牵制。在植物进化过程中，种子的大小和种子数目之间也存在着同样的负相关性。因此，通过分子遗传学方法揭示每穗粒数和粒重之间的分子调控机理具有重要的生物学意义，而且可以为作物产量的遗传改良提供了技术方法。目前本领域稻类控制水稻粒数和粒重的基因的克隆和研究至今还没有获得突破。因此，本领域迫切需要开展控制水稻粒型和粒重等相关基因的功能研究，以便用于改善植物的性状。发明内容本发明的目的就是提供控制水稻等植物的粒型、粒重和粒数等相关基因及其应用。本发明的第一方面提供了一种物质的用途，所述物质为GSN1基因或其编码蛋白、或其突变蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控植物的性状或用于制备调控植物的性状的组合物，所述性状包括选自下组的一种或多种性状：i粒型；ii穗粒数；iii结实率。在另一优选例中，所述性状还包括选自下组的一种或多种性状：iv株高；v分蘖数；vi单株产量；vii一级枝梗数；viii二级枝梗数；ix长角果；x穗长。在另一优选例中，所述粒型包括粒长、粒宽、和或千粒重。在另一优选例中，所述的组合物为农用组合物。本发明第二方面提供了一种物质的用途，所述物质为GSN1基因或其编码蛋白、活性增强的GSN1突变蛋白、或其促进剂，调控植物的性状或用于制备调控植物的性状的组合物，其中所述性状包括选自下组的一种或多种性状：i缩小粒型；ii增加穗粒数；iii增加结实率。在另一优选例中，所述的活性为GSN1的去磷酸化活性。在另一优选例中，所述的活性增强指所述突变蛋白的去磷酸化活性A1与野生型GSN1蛋白的去磷酸化活性A0之比≥1.2，较佳地≥1.5。在另一优选例中，所述物质为GSN1基因或其编码蛋白、或其促进剂，其还用于调控植物的以下一种或多种性状：iv在禾本科植物中增加分蘖数；v在拟南芥中导致分枝增多；vi在拟南芥中导致长角果缩短。在另一优选例中，所述促进剂为促进GSN1基因或其编码蛋白表达的小分子化合物。在另一优选例中，所述的促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子、或其组合。在另一优选例中，所述植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草包括草坪草；优选地包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更优选地包括水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥。在另一优选例中，所述的植物包括：水稻、小麦、玉米、高粱、十字花科植物卷心菜。在另一优选例中，所述的水稻选自下组：籼稻、粳稻、或其组合。在另一优选例中，所述的GSN1基因选自下组：cDNA序列、基因组序列、或其组合。在另一优选例中，所述GSN1基因来自禾本科植物。在另一优选例中，所述的GSN1基因来自选自下组的一种或多种植物：水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥、谷子、苜蓿、二穗短柄草、番茄、毛果杨、桃、耧斗菜。在另一优选例中，所述GSN1蛋白的氨基酸序列选自下组：i具有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的多肽；ii将如SEQIDNO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个如1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控农艺性状功能或具有去磷酸化活性的、由i衍生的多肽；或iii氨基酸序列与SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的同源性≥80％较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％，具有所述GSN1活性的多肽。在另一优选例中，所述GSN1基因的核苷酸序列选自下组：a编码如SEQIDNO.:2所示多肽的多核苷酸；b序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸；c核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示序列的同源性≥75％较佳地≥85％，更佳地≥90％或≥95％的多核苷酸；d在SEQIDNO.:1所示多核苷酸的5'端和或3'端截短或添加1-60个较佳地1-30，更佳地1-10个核苷酸的多核苷酸；e与a-d任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。本发明第三方面提供了一种物质的用途，所述物质为GSN1突变蛋白、或其抑制剂，所述的突变蛋白为与野生型GSN1蛋白相比活性下降的GSN1突变蛋白，用于调控植物的以下一种或多种性状：i增大粒型；ii减少穗粒数；iii减少结实率。在另一优选例中，所述物质为GSN1活性下降的突变蛋白。在另一优选例中，所述的活性为GSN1的去磷酸化活性。在另一优选例中，所述的活性下降指所述突变蛋白的去磷酸化活性A1与野生型GSN1蛋白的去磷酸化活性A0之比≤0.8，较佳地≤0.6。在另一优选例中，所述的GSN1突变蛋白是活性丧失的突变蛋白。在另一优选例中，所述物质还用于调控植物的以下一种或多种性状：iv在禾本科植物中减少分蘖数；v在拟南芥中导致分枝减少；vi在拟南芥中导致长角果变长。在另一优选例中，所述突变蛋白的氨基酸序列选自下组：i具有SEQIDNO.:3所示氨基酸序列的多肽；ii将如SEQIDNO.:3所示的氨基酸序列经过一个或几个如1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控农艺性状功能的、由i衍生的多肽；或iii氨基酸序列与SEQIDNO.:3所示氨基酸序列的同源性≥80％较佳地≥90％，更佳地≥95％或98％，且具有下降的GSN1蛋白活性的多肽。在另一优选例中，所述编码突变蛋白的核苷酸序列选自下组：a编码如SEQIDNO.:3所示多肽的多核苷酸；b序列如SEQIDNO.:4所示的多核苷酸；c核苷酸序列与SEQIDNO.:4所示序列的同源性≥75％较佳地≥85％，更佳地≥90％的多核苷酸；d在SEQIDNO.:4所示多核苷酸的5'端和或3'端截短或添加1-60个较佳地1-30，更佳地1-10个核苷酸的多核苷酸；e与a-d任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述的抑制剂选自下组：小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、Crispr试剂、或其组合。在另一优选例中，当所述物质为GSN1基因或其编码蛋白包括活性增加的突变蛋白、或其促进剂时，所述物质还用于：a对MPK1蛋白进行去磷酸化修饰。在另一优选例中，当所述物质对MPK1蛋白进行去磷酸化修饰时，所述植物的性状表现为：粒型变小、和或穗粒数增加。在另一优选例中，当所述物质为GSN1活性下降的突变蛋白或GSN1抑制剂时，所述物质还用于：a抑制MPK1蛋白的去磷酸化修饰。在另一优选例中，当所述物质如GSN1活性下降的突变蛋白或GSN1抑制剂抑制MPK1蛋白的去磷酸化修饰时，所述植物的性状表现为：粒型变大、和或穗粒数减少。本发明第四方面提供了一种改良植物性状的方法，包括步骤：i调节所述植物中GSN1蛋白的表达量和或活性，从而改良植物性状。在另一优选例中，在步骤i中，调节野生型GSN1蛋白和突变型gns1蛋白的相对表达量，从而改良植物性状。在另一优选例中，所述的突变型gns1蛋白的去磷酸化活性下降或缺失。在另一优选例中，在步骤i中，上调野生型GSN1基因的表达量和或活性。在另一优选例中，在步骤i中，下调野生型GSN1基因的表达量和或活性。在另一优选例中，所述野生型GSN1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。在另一优选例中，所述GSN1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述突变型gsn1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:3所示。在另一优选例中，所述gsn1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.:4所示。在另一优选例中，当所述植物中GSN1的活性E1与所述植物中的野生型GSN本底活性E0之比≥2倍，较佳地≥5倍，更佳地≥10倍时，所述植物的性状改良为粒型变小和或穗粒数增加。在另一优选例中，当所述植物中GSN1的活性E1与所述植物中的野生型GSN本底活性E0之比≤12，较佳地≤15，更佳地≤110时，所述植物的性状改良为粒型变大和或穗粒数减少。本发明第五方面提供了一种对MPK1蛋白进行去磷酸化的方法，包括步骤：将GSN1蛋白与MPK1蛋白接触，从而对MPK1蛋白进行去磷酸化。在另一优选例中，所述的GSN1蛋白包括野生型GSN1蛋白或其突变蛋白。在另一优选例中，所述的突变蛋白包括活性增强的突变蛋白。在另一优选例中，所述MPK1蛋白的来源选自下组的一种或多种植物：水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥、谷子、苜蓿、二穗短柄草、番茄、毛果杨、桃、耧斗菜。本发明第六方面提供了一种分离的突变型GSN1蛋白，所述突变型GSN1蛋白为非天然蛋白，且所述突变型GSN1蛋白具有调控植物性状的活性，所述性状选自下组的一种或多种性状：i粒型；ii穗粒数；iii结实率。在另一优选例中，所述的突变型GSN1蛋白包括活性增加的突变蛋白、或活性下降的突变蛋白。在另一优选例中，所述突变型GSN1蛋白是活性下降的突变蛋白。在另一优选例中，所述突变型GSN1蛋白在野生型的GSN1蛋白的对应于SEQIDNO.:2的选自下组的核心氨基酸发生突变：第146位丝氨酸S。在另一优选例中，所述第146位氨基酸突变为苯丙氨酸F。在另一优选例中，所述突变型GSN1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:3所示。在另一优选例中，所述突变型GSN1蛋白除所述突变如146位氨基酸外，其余的氨基酸序列与SEQIDNO.:2所示的序列相同或基本相同。在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述突变型GSN1蛋白仍具有去磷酸化活性如使得MPK1蛋白发生去磷酸化的活性。在另一优选例中，与SEQIDNO.:2所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％或90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。在另一优选例中，所述的突变型GSN1蛋白还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列如6His、或其组合。在另一优选例中，所述突变型GSN1蛋白具有调控植物性状的活性，所述性状选自下组的一种或多种性状：i粒型变大；ii穗粒数减少；iii结实率下降。本发明第七方面提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第六方面所述的突变型GSN1蛋白。在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：a编码如SEQIDNO.:3所示多肽的多核苷酸；b序列如SEQIDNO.:4所示的多核苷酸；c核苷酸序列与SEQIDNO.:4所示序列的同源性≥80％较佳地≥90％，且编码SEQIDNO.:3所示多肽的多核苷酸；d与a-c任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：DNA序列、RNA序列、或其组合。本发明第八方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第七方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。本发明第九方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第八方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或植物细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。本发明第十方面提供了一种产生本发明第六方面所述的突变型GSN1蛋白的方法，包括步骤：在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞，从而表达出突变型GSN1蛋白；和分离所述突变型GSN1蛋白。本发明第十一发明提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明第六方面所述的突变型GSN1蛋白。本发明第十二方面提供了一种制备转基因植物的方法，包括步骤：将编码本发明第六方面所述蛋白的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。在另一优选例中，所述方法包括步骤：s1提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码本发明第六方面所述蛋白的多核苷酸；s2将植物细胞或组织或器官与步骤s1中的农杆菌接触，从而使编码本发明第六方面所述蛋白的多核苷酸转入植物细胞、组织或器官；s3筛选转入编码本发明第六方面所述蛋白的多核苷酸的植物细胞或组织或器官；和s4将步骤s3中的植物细胞或组织或器官再生成植物。本发明第十三方面提供了一种鉴定大粒型或小粒型植物的方法，包括步骤：i鉴定植物样本是否具有SEQIDNO.:2或3所示氨基酸序列的多肽或其编码基因；如具有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的多肽或其编码基因，则为小粒型植物，如具有由SEQIDNO.:3所示氨基酸序列的多肽或其编码基因，则为大粒型植物。在另一优选例中，在步骤i中，通过测序确定所述植物样本中是否具有如SEQIDNO.:1或SEQIDNO.:4所示的核苷酸序列。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文如实施例中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。图1显示了gsn1突变体的表型特征。A野生型FAZ1一个籼稻品种“丰矮占1号”的简称和gsn1的株型；BFAZ1和gsn1的粒型；C脱壳后的FAZ1和gsn1籽粒；DFAZ1和gsn1的穗型；EFAZ1和gsn1的雌蕊；FFAZ1和gsn1的花药；G-QFAZ1和gsn1的表型比较，包括株高G、分蘖数H、粒长I、粒宽J、千粒重K、穗粒数L、结实率M、单株产量N、一级枝梗数O、二级枝梗数P和穗长Q。图2显示了GSN1基因的定位克隆以及遗传互补验证。AGSN1的图位克隆；B不同物种中GSN1蛋白保守区域序列比对；C-DFAZ1、gsn1以及互补植株gGSN1com的穗型C和粒型D；E-FFAZ1以及RNAi植株GSN1RNAi的穗型E和粒型F；G-HFAZ1以及过表达植株UBI::GSN1的穗型G和粒型H；I-JFAZ1以及RNAi植株GSN1RNAi的粒长I和穗粒数J比较；K-LFAZ1、gsn1以及过表达植株UBI::GSN1的粒长K和穗粒数L比较。图3显示了粳稻品种95-22和近等基因系NILgsn1的表型特征。A95-22和近等基因系NILgsn1的株型；B95-22和近等基因系NILgsn1的穗型；C95-22和近等基因系NILgsn1的粒型；D95-22和近等基因系NILgsn1脱壳的粒型；E-G95-22和近等基因系NILgsn1的粒长E、粒宽F、和穗粒数G比较。图4显示了抑制GSN1导致水稻粒型增大，每穗粒数减少。A粳稻品种ZH11和GSN1RNAi植株的株型、粒型和穗型表型；BZH11和GSN1CRISPR植株的株型、粒型和穗型表型；C-FZH11和GSN1RNAi的粒长C、粒宽D、穗粒数E、以及体内GSN1基因的相对表达量F；G-JZH11和GSN1CRISPR的粒长G、粒宽H、穗粒数I、以及GSN1基因CRISPRCas9基因编辑位点J。图5显示了ZH11背景下过表达突变来源于gsn1突变体的GSN1具有显性负抑制效应。A粳稻ZH11和过表达GSN1FAZ1来源于FAZ1植株UBI::GSN1FAZ1的株型、粒型和穗型；B粳稻ZH11和过表达GSN1S146F来源于gsn1植株UBI::GSN1S146F的株型、粒型和穗型；C-FZH11和UBI::GSN1FAZ1的粒长C、粒宽D、穗粒数E以及GSN1的相对表达量F；G-JZH11和UBI::GSN1S146F的粒长G、粒宽H、穗粒数I以及GSN1的相对表达量J。图6显示了过表达GSN1导致每穗粒数增多、粒型减小。A粳稻ZH11和过表达GSN1ZH11来源于ZH11植株UBI::GSN1ZH11的株型、粒型和穗型；B粳稻ZH11和过表达GSN1ZH11植株35S::GSN1ZH11的株型、粒型和穗型；C-FZH11和UBI::GSN1ZH11的粒长C、粒宽D、穗粒数E以及GSN1的相对表达量F；G-JZH11和35S::GSN1ZH11的粒长G、粒宽H、穗粒数I以及GSN1的相对表达量J。图7显示了GSN1突变导致细胞分裂加快，而不影响细胞的扩展或伸长。A抽穗期FAZ1和gsn1的颖壳；BFAZ1和gsn1颖壳的横切面；C颖壳横切面的局部放大；DFAZ1和gsn1花药横切面比较；E颖壳横切面薄壁细胞数量和大小比较；F花药横切面药隔维管束面积和细胞数量比较；GFAZ1和gsn1颖壳外表皮乳突扫描电镜观察；HFAZ1和gsn1颖壳内表皮细胞扫描电镜观察；IFAZ1和gsn1颖壳外表皮乳突间距比较；JFAZ1和gsn1颖壳内表皮细胞大小比较；KFAZ1和gsn1幼穗颖壳细胞的流式细胞分析；LFAZ1和gsn1幼穗颖壳细胞的细胞周期分布比较。图8显示了GSN1编码一个定位于细胞质的双特异性磷酸酶，第146位丝氨酸突变为苯丙氨酸导致GSN1蛋白失去去磷酸化活性。A-B分别以PNPPA和OMFPB为底物检测GSN1和GSN1S146F的酶活；CGSN1的酶活动力学曲线；DGSN1定位于烟草叶片表皮细胞的细胞质内；EGSN1定位于水稻原生质体的细胞质内；F-GGSN1在苗期F和生殖生长期G的表达模式。图9显示了GSN1和OsMPK1特异性发生互作，并对OsMPK1进行去磷酸化修饰。A酵母双杂交验证GSN1和OsMPK1在酵母细胞内发生互作；BBiFC实验验证GSN1和OsMPK1在烟草叶片表皮细胞内发生互作；Cco-IP实验证明GSN1和OsMPK1发生互作；DGSN1可以对OsMPK1进行去磷酸化修饰，GSN1S146F不能对OsMPK1进行去磷酸化修饰。图10显示了GSN1是水稻OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1级联反应通路的负调控因子。AFAZ1、gsn1、OsMPK1RNAi和gsn1OsMPK1RNAi双突的穗型；BFAZ1、gsn1、OsMPK1RNAi和gsn1OsMPK1RNAi双突的粒型；CFAZ1、gsn1、OsMKK4CRISPR和gsn1OsMKK4CRISPR双突的穗型；DFAZ1、gsn1、OsMKK4CRISPR和gsn1OsMKK4CRISPR双突的粒型；EFAZ1、gsn1、OsMKKK10CRISPR和gsn1OsMKKK10CRISPR双突的穗型；FFAZ1、gsn1、OsMKKK10CRISPR和gsn1OsMKKK10CRISPR双突的粒型；GFAZ1、gsn1、OsMPK1RNAi和gsn1OsMPK1RNAi双突的粒长比较；HFAZ1、gsn1、OsMKK4CRISPR和gsn1OsMKK4CRISPR双突的粒长比较；IFAZ1、gsn1、OsMKKK10CRISPR和gsn1OsMKKK10CRISPR双突的粒长比较。图11显示了在拟南芥中过表达水稻GSN1基因导致其分枝增多、长角果变短。表明GSN1在其他物种中也发挥作用、具有功能保守性。其中，CK为对照，#1和#2为35S::GSN1过表达转基因植株两个独立株系，比例尺5cm。具体实施方式经过广泛而深入的研究，本发明人通过对大量的植物性状位点的研究，首次意外地发现了一种植物如水稻的GSN1基因或其编码蛋白、或其突变蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控植物的性状，所述性状包括选自下组的一种或多种性状：i粒型；ii穗粒数；iii结实率。此外，本发明人还首次意外地发现，将植物中的GSN1蛋白的第146为氨基酸丝氨酸突变为苯丙氨酸，可显著增加粒型，并减少穗粒数。此外，本发明人还首次意外地发现，通过调节植物中GSN1蛋白的表达活性，可改良植物的性状。实验结果表明，本发明的野生型GSN1蛋白可与OsMPK1发生作用，并对OsMPK1进行去磷酸化修饰，而一种活性缺失的突变型gsn1蛋白不能对已发生磷酸化的GST-OsMPK1进行去磷酸化修饰。在此基础上，本发明人完成了本发明。术语如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“D308N”表示第308位的氨基酸D突变为N，以此类推。本发明突变蛋白及其编码核酸如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“突变型GSN1蛋白”、“本发明突变型GSN1蛋白”可互换使用，均指非天然存在的GSN1突变蛋白，且所述突变蛋白为基于SEQIDNO.:2所示蛋白进行人工改造的蛋白，其中，所述的突变蛋白含有与调控植物性状如粒型、穗粒重活性相关的核心氨基酸，且所述核心氨基酸中至少有一个是经过人工改造的；并且本发明突变蛋白具有增加粒型、和或减少穗粒数的活性。术语“核心氨基酸”指的是基于SEQIDNO.:2，且与SEQIDNO.:2同源性达至少80％，如84％、85％、90％、92％、95％、98％的序列中，相应位点是本文所述的特定氨基酸，如基于SEQIDNO.:2所示的序列，核心氨基酸为：第146位丝氨酸S；且对上述核心氨基酸进行突变所得到的活性下降的突变蛋白具有增加粒型、和或减少穗粒数的活性。优选地，在本发明中，对本发明的所述核心氨基酸进行如下突变：第146位丝氨酸S突变为苯丙氨酸F，该突变可导致GSN1蛋白的活性大幅下降甚至丧失。应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于SEQIDNO.:2作出，当某一具体突变蛋白与SEQIDNO.:2所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQIDNO.:2的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％如90％、95％、98％的、具有相同或相似的增加粒型、和或减少穗粒数的活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主例如，细菌、酵母、植物中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是i有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基优选保守性氨基酸残基被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或ii在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或iii成熟突变蛋白与另一个化合物比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇融合所形成的突变蛋白，或iv附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I最初的残基代表性的取代优选的取代AlaAVal；Leu；IleValArgRLys；Gln；AsnLysAsnNGln；His；Lys；ArgGlnAspDGluGluCysCSerSerGlnQAsnAsnGluEAspAspGlyGPro；AlaAlaHisHAsn；Gln；Lys；ArgArgIleILeu；Val；Met；Ala；PheLeuLeuLIle；Val；Met；Ala；PheIleLysKArg；Gln；AsnArgMetMLeu；Phe；IleLeuPheFLeu；Val；Ile；Ala；TyrLeuProPAlaAlaSerSThrThrThrTSerSerTrpWTyr；PheTyrTyrYTrp；Phe；Thr；SerPheValVIle；Leu；Met；Phe；AlaLeu本发明的活性下降的突变蛋白具有增加粒型、和或减少穗粒数的活性。一种活性缺失的GSN1突变蛋白如SEQIDNO.:3所示。应理解，本发明突变蛋白与SEQIDNO.:3所示的序列相比，通常具有较高的同源性相同性，优选地，所述的突变蛋白与SEQIDNO.:3所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％。此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰通常不改变一级结构形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。本发明还提供了编码GSN1多肽、蛋白或其变体的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括：DNA、基因组DNA或人工合成的DNA，DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO.:4所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和或非编码序列的多核苷酸。在本发明中，一种优选的编码突变蛋白gsn1的多核苷酸序列如SEQIDNO.:4所示。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件或严紧条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：1在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或2杂交时加有变性剂，如50％vv甲酰胺，0.1％小牛血清0.1％Ficoll，42℃等；或3仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。应理解，虽然本发明的GSN1基因优选来自水稻，但是来自其它植物的与水稻GSN1基因高度同源如具有80％以上，如85％,90％,95％甚至98％序列相同性的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白或其片段，或其衍生物的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子或如载体和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。应用PCR技术扩增DNARNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法RACE-cDNA末端快速扩增法，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNARNA片段。野生型GSN1蛋白和基因如本文所用，“野生型GSN1蛋白”、“野生型控制水稻粒数和粒重的GSN1蛋白”可互换使用，是指天然存在的、未经过人工改造的GSN1蛋白，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应PCR等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。在本发明中，GSN1的基因包括基因组基因以及cDNA基因。对于水稻而言，一种典型的野生型GSN1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。一种典型的编码野生型GSN1蛋白的cDNA核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示，而水稻的GSN1基因组序列的登录号为LOC_Os05g02500。代表性的其他物种的GSN1同源基因包括但并不限于：水稻的GSN1基因OsGSN1、玉米的GSN1同源基因GRMZM2G005350和水稻相似性84.4％、高粱的GSN1同源基因Sobic.009G017400和水稻相似性89.5％、小麦的GSN1同源基因A基因组Traes_1AS_73C2E93D4和水稻相似性87％；B基因组Traes_1BS_90AEC8678和水稻相似性84.6％；D基因组Traes_1DS_4C0964710和水稻相似性88.1％、谷子的GSN1同源基因Seita.3G061100和水稻相似性80.4％、二穗短柄草的GSN1同源基因Bradi2g37450和水稻相似性83.4％、大豆的GSN1同源基因Glyma.02G095100和水稻相似性62.4％、拟南芥的GSN1同源基因AT3G55270和水稻相似性59.7％、苜蓿的GSN1同源基因Medtr7g023250和水稻相似性65.7％、番茄的GSN1同源基因Solyc05g054700和水稻相似性53.1％、毛果杨的GSN1同源基因Potri.008G049900和水稻相似性58.8％、桃的GSN1同源基因Prupe.2G228100和水稻相似性63.4％、耧斗菜的GSN1同源基因Aqcoe1G474900和水稻相似性64.5％。表达载体本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：1.用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；2.在合适的培养基中培养的宿主细胞；3.从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括从5'到3'方向：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等；增强子；或操作子。在本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码DNA序列和合适的转录翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。包括本发明基因、表达盒或载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白GFP，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞如水稻细胞。本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法如温度转换或化学诱导诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理盐析方法、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析HPLC和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的主要优点包括：1本发明的GSN1或其编码蛋白、或其突变蛋白、或其促进剂、或其抑制剂可调控植物的农艺性状比如，粒型、穗粒数和结实率等。2将所述植物中GSN1蛋白的第146位氨基酸丝氨酸突变为苯丙氨酸，可显著改善植物的性状如增大粒型、减少穗粒数等。3本发明的GSN1蛋白具有去磷酸化活性，而发生突变的GSN1S146F蛋白失去了去磷酸化能力。4本发明首次发现，完整OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1级联信号通路参与水稻粒型和穗型发育。5本发明首次发现，GSN1是OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1信号通路的负调控因子，通过精准调控该信号通路来平衡水稻每穗粒数和粒型粒重大小。6本发明首次发现，植物OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1级联信号通路是参与植物发育过程的负调控因子。7本发明首次发现，基于GSN1的对植物种子大小和种子数目发育平衡进行调控的分子遗传机制。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非有特别说明，否则实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。通用方法1.实验材料和定位克隆本发明利用籼稻品种FAZ1进行EMS诱变，然后筛选穗型、粒型突变体gsn1，再将其和FAZ1回交纯化背景。为了定位gsn1突变体基因，将其与粳稻品种ZH11杂交产生F1群体，进而产生F2分离群体，用于后续定位。首先，利用682株水稻将GSN1初定位在第五号染色体的短臂端，分子标记G05220和G05591之间。然后，利用13792株水稻将其精细定位在分子标记G05333和G05340之间，大约17.5kb。这个区间内有两个候选基因LOC_Os05g02490和LOC_Os05g02500。我们通过引物GSN1Genotyping测序发现候选基因LOC_Os05g02500编码区的第437位碱基由C突变为T，进而导致第146位丝氨酸突变为苯丙氨酸。因此，猜测候选基因LOC_Os05g02500可能就是GSN1。G05220的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-ATAGCTAGAGAGAGCGGTCA-3'SEQIDNO.:53'端引物序列为：5'-GAGAGTAACTGAAGCAGCAAG-3'SEQIDNO.:6G05591的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-TGACTTTAAGGGCCTGTTT-3'SEQIDNO.:73'端引物序列为：5'-GGGGTATTTCAGACAATTCA-3'SEQIDNO.:8G05333的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-CTGGATATACATGTGTCTAATTCT-3'SEQIDNO.:93'端引物序列为：5'-GCATATCCAGGTTAATTTATAGC-3'SEQIDNO.:10G05340的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-TGGCTAAAATAATATCGTATCG-3'SEQIDNO.:113'端引物序列为：5'-AGGATCTCAGTTGCAGTAATCT-3'SEQIDNO.:12GSN1Genotyping的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-GGGGGTTCTTCTACTTTTGTTTTT-3'SEQIDNO.:133'端引物序列为：5'-CTCCACATCAAGTACGCTATCACC-3'SEQIDNO.:142.遗传互补验证、过表达、RNA干扰和CRISPRCas9基因编辑为了进一步验证候选基因LOC_Os05g02500，将来源于野生型FAZ1的LOC_Os05g02500全长基因组序列构建到pCOMBIA1300互补载体上，然后通过根癌农杆菌EHA105介导的水稻幼胚转化法进行遗传转化，筛选转基因阳性株系。另外，将来源于FAZ1的GSN1基因构建到pCOMBIA1301载体上，在泛素启动子驱动下过表达GSN1基因。为了干扰GSN1、OsMPK1的表达，分别设计了人工小干扰RNA和反义RNA，以此来抑制GSN1、OsMPK1的表达。CRISPRCas9技术用于基因编辑，根据实验需要，针对几个目的基因GSN1、OsMKK4、OsMKKK10分别设计了CRISPRCas9基因敲除载体，用于目的基因的敲除。和遗传互补相同，通过根癌农杆菌EHA105介导的水稻幼胚转化法进行遗传转化，筛选转基因阳性株系，种植在大田并在转基因T2代考察表型。pCOMBIA1300互补载体构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-GATCAATAAAAGATGGTCATCAGTG-3'SEQIDNO.:153'端引物序列为：5'-GGAGATAGGAAAGGTGGTGATGT-3'SEQIDNO.:16pCOMBIA1301过表达载体构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-CACCATGGCCACGCCCGACGACGGCG-3'SEQIDNO.:173'端引物序列为：5'-ACGAGCATTCAGCACTTCCAAAAGAT-3'SEQIDNO.:18GSN1人工小干扰RNA载体构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-TCGGTACCCAGCAGCAGCCACAGCAAAA-3'SEQIDNO.:193'端引物序列为：5'-TCTCTAGAGCTGCTGATGCTGATGCCAT-3'SEQIDNO.:20OsMPK1人工反义RNA载体构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-CCCGGATCCGAGCTCATGGACGCCGGGGCGCAGCC-3'SEQIDNO.:213'端引物序列为：5'-GGGGGTACCACTAGTTTGTACTTGGCGGTGACCTC-3'SEQIDNO.:22CRISPRCas9敲除GSN1载体构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-GGCAGTTCTGGCGCTCCGCGTCG-3'SEQIDNO.:233'端引物序列为：5'-AAACCGACGCGGAGCGCCAGAAC-3'SEQIDNO.:24CRISPRCas9敲除OsMKK4载体构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-GGCAGCGACGTGAGGTCCCGCTG-3'SEQIDNO.:253'端引物序列为：5'-AAACCAGCGGGACCTCACGTCGC-3'SEQIDNO.:26CRISPRCas9敲除OsMKKK10载体构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-GGCACCTCATCGATACATTTCAT-3'SEQIDNO.:273'端引物序列为：5'-AAACATGAAATGTATCGATGAGG-3'SEQIDNO.:283.GSN1酶活检测GSN1编码一个去磷酸化酶，具有去磷酸化能力。本发明猜测gsn1突变体背景下的GSN1S146F失去了去磷酸化能力。因此，在体外分别纯化MBP-GSN1和MBP-GSN1S146F融合蛋白，然后分别以磷酸盐PNPPp-nitrophenylphosphate和OMFP3-o-methylfluoresceinphosphate为底物，在吸光度值405nm和477nm处进行检测以评估MBP-GSN1和MBP-GSN1S146F的去磷酸化能力。纯化的MBP蛋白可以被用作阴性对照。和猜测的一致，GSN1S146F的确失去了去磷酸化活性。MBP-GSN1和MBP-GSN1S146F蛋白表达载体pMAL-c5x构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-CGGGATCGAGGGAAGGATTTCAATGGCCACGCCCGA-3'SEQIDNO.:293'端引物序列为：5'-AGCTTATTTAATTACCTGCAGGTTAACGAGCATTCAGC-3'SEQIDNO.:304.细胞学检测gsn1突变体和野生型FAZ1相比，具有明显增加的粒长和粒宽，因此进行了一系列观察来研究水稻粒型变大的细胞学基础。选取大苞期即将抽穗的水稻颖壳固定在FAA中，一部分用于石蜡包埋半薄切片，一部分用于颖壳外表皮和内表皮的电镜扫描观察。石蜡包埋半薄切片用于观察统计颖壳横切面薄壁细胞的大小和数目，以此来反映细胞的伸长或者分裂。对FAA固定的样品脱水干燥后进行电镜扫描观察，颖壳内表皮主要是观察内表皮细胞的大小以及单位面积内细胞的数目；颖壳外表皮主要是观察表面乳突之间的距离每个细胞中间都有一个乳突，据此可以来判断细胞的平均大小。一般而言，处于分裂旺盛期的细胞，其四倍体细胞数目相对增多，细胞周期的分布也发生了变化。据此，选取了幼嫩的水稻幼穗和颖壳，提取细胞核后用DAPI染色，再用流式细胞仪分析每个样品的细胞倍性，以此来比较FAZ1和gsn1样品细胞分裂的相对速率。5.蛋白互作检测为了寻找GSN1蛋白的互作蛋白和去磷酸化底物，利用酵母双杂交技术进行了体外蛋白的互作验证。分别将GSN1和OsMPK1基因的编码序列融合构建在PGBKT7和PGADT7载体上，然后共转酵母Y2HGOLD菌株，让其在三缺或者四缺的SD培养基上生长，3天后根据菌斑的大小和颜色判断两个目的蛋白GSN1和OsMPK1是否发生互作。基于酵母双杂交的结果，发现GSN1和OsMPK1发生互作。因此，我们又利用双分子荧光互补BiFC技术进一步在烟草体内进行了验证。分别将GSN1和OsMPK1基因的编码区构建在YFP的N端和C端，即nYFP-GSN1和cYFP-OsMPK1，然后经农杆菌介导将其共转烟草，暗下培养48小时后利用激光共聚焦显微镜进行观察。BiFC实验发现，GSN1和OsMPK1的确发生互作。又更进一步利用免疫共沉淀co-IP技术确实了这个结果。即将GSN1融合在含有Flag标签的载体上，将OsMPK1融合在含有Myc标签的载体上，然后经农杆菌介导共转烟草，培养48小时后提取烟草总蛋白。接着，用亲和Flag标签蛋白的磁珠和烟草总蛋白孵育，使得带有Flag标签的蛋白结合在磁珠上，洗脱磁珠后用Flag和Myc抗体分别进行检测。co-IP实验也验证了GSN1和OsMPK1在体内发生互作。酵母双杂交载体PGBKT7-GSN1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-ATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCCACGCCCGA-3'SEQIDNO.:313'端引物序列为：5'-TGCGGCCGCTGCAGGTCGTGCGGCCGCTGCAGGTCG-3'SEQIDNO.:32酵母双杂交载体PGADT7-GSN1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-ATGGCCATGGAGGCCAGTGAAATGGCCACGCCCGA-3'SEQIDNO.:333'端引物序列为：5'-TGCAGCTCGAGCTCGATGGATCGGCCGCTGCAGGTCG-3'SEQIDNO.:34酵母双杂交载体PGBKT7-OsMPK1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-ATGGCCATGGAGGCatggacgccggggcgcagccgc-3'SEQIDNO.:353'端引物序列为：5'-TGCGGCCGCTGCAGGTctactggtaatcagggttgaacgcaa-3'SEQIDNO.:36酵母双杂交载体PGADT7-OsMPK1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-ATGGCCATGGAGGCCatggacgccggggcgcagccgc-3'SEQIDNO.:373'端引物序列为：5'-TGCAGCTCGAGCTCctactggtaatcagggttgaacgcaa-3'SEQIDNO.:38BiFC载体nYFP-GSN1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-GATTTCTGAGGAGGATCTTCCCGGGGCCACGCCCGA-3'SEQIDNO.:393'端引物序列为：5'-AAGCAGGGCATGCCTGCAGGTCGACTTAACGAGCATT-3'SEQIDNO.:40BiFC载体cYFP-GSN1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-CGACTCTAGGAGCTCGGTACCCGGGATGGCCACGCC-3'SEQIDNO.:413'端引物序列为：5'-GAACATCGTATGGGTACATACTAGTACGAGCATTCA-3'SEQIDNO.:42BiFC载体nYFP-OsMPK1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-GATTTCTGAGGAGGATCTTCCCGGGgacgccggggcgc-3'SEQIDNO.:433'端引物序列为：5'-AAGCAGGGCATGCCTGCAGGTCGACctactggtaatcaggg-3'SEQIDNO.:44BiFC载体cYFP-OsMPK1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-CGACTCTAGGAGCTCGGTACCCGGGatggacgccggggcg-3'SEQIDNO.:453'端引物序列为：5'-GAACATCGTATGGGTACATACTAGTctggtaatcagggttga-3'SEQIDNO.:46Co-IP载体pCOMBIA1306-Flag-GSN1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-AGAGAACACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGCCAC-3'SEQIDNO.:473'端引物序列为：5'-ATCCAAGGGCGAATTGGTCGACTCTAGAACGAGCATT-3'SEQIDNO.:48Co-IP载体pCOMBIA1301-Myc-OsMPK1构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-tttggagagaacacgggggactTCTAGAatggacgccggggcgcagccgc-3'SEQIDNO.:493'端引物序列为：5'-tcggagattagcttttgttcGGATCCctggtaatcagggttgaacgca-3'SEQIDNO.:506.磷酸化和去磷酸化检测通过体外和体内实验证明GSN1和OsMPK1蛋白互作之后，还需要在体外验证GSN1是否可以对OsMPK1进行去磷酸化修饰。分别纯化了MBP-GSN1、MBP-GSN1S146F、MBP-OsMKK4CA以及GST-OsMPK1融合蛋白。首先，利用纯化的融合蛋白MBP-OsMKK4CA磷酸化修饰GST-OsMPK1，此修饰发生在GST-OsMPK1的TEYmotif上，可以用磷酸化抗体phos-p4244检测。然后，把纯化的融合蛋白MBP-GSN1、MBP-GSN1S146F和已经被磷酸化修饰的GST-OsMPK1共同孵育，利用磷酸化抗体phos-p4244来检测磷酸化GST-OsMPK1的去磷酸化程度。GST-OsMPK1蛋白表达载体构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-CCGGAATTCCCATGGCCACGCCCGACGACGGCG-3'SEQIDNO.:513'端引物序列为：5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTAACGAGCATTCAGCACTTCC-3'SEQIDNO.:52MBP-OsMKK4CA蛋白表达载体构建的5'端寡核苷酸引物序列为：5'-CGGGATCGAGGGAAGGATTTCAATGCGACCGGGCGG-3'SEQIDNO.:533'端引物序列为：5'-AGCTTATTTAATTACCTGCAGGTCATGACGGAGGCGG-3'SEQIDNO.:54实施例1通过对水稻籼稻品种丰矮占1号FAZ1进行EMS诱变，获得了一个水稻粒型明显变大、每穗粒数减少的突变体gsn1，并克隆了控制其表型的GSN1基因gsn1突变体粒长、粒宽和千粒重明显增加；每穗粒数明显减少；花器官增大、育性减弱。因此，gsn1突变体是研究产量因素每穗粒数和粒重互作关系的好材料如图1所示。利用gsn1突变体和粳稻品种中花11的F2分离群体成功定位并克隆了候选基因GSN1。通过研究表明，来自gsn1突变体背景的GSN1等位基因第437位核苷酸C突变为T，从而导致编码蛋白的第146位丝氨酸突变为苯丙氨酸。通过转基因遗传互补验证确认了候选基因GSN1，正是由于它的突变才导致了gsn1的表型。另外，发现在野生型FAZ1背景下降低下调GSN1的表达可以使得水稻籽粒增大，穗粒数减少；相反，增强提高GSN1的表达使得籽粒减小，穗粒数增加如图2所示。另外，将突变体gsn1与粳稻品种95-22进行多代回交，然后在BC6F2中获得只含有gsn1突变位点的近等基因系NILgsn1。该近等基因系表现出和gsn1突变体极其相似的表型：籽粒变大、穗粒数减少，表明该基因在籼稻和粳稻中均对粒重和粒数有调控作用。因此，GSN1基因是一个非常具有潜力的平衡水稻每穗粒数和粒型的遗传改良位点如图3所示。实施例2在粳稻品种ZH11背景下过表达突变的GSN1具有显性负抑制效应GSN1是一个每穗粒数的正调控因子，但同时又是粒重粒型的负调控因子。在粳稻ZH11背景下降低GSN1的表达可以使得水稻每穗粒数减少，籽粒增大。相反，在其背景下分别过表达来自ZH11的等位基因GSN1ZH11和FAZ1的等位基因GSN1都可以使得每穗粒数增多而籽粒减小。据此，在ZH11背景下过表达来自gsn1突变体的GSN1等位基因，发现水稻粒型变大，穗粒数减少，和GSN1受到抑制后的表型基本一致。因此，推断在ZH11背景下过表达GSN1突变基因具有显性负抑制效应如图4、图5和图6所示。实施例3GSN1的突变导致特异性影响细胞分裂，而不影响细胞的扩展或伸长由于gsn1突变体的粒长和粒宽均有增加，花器官也相应增大，在细胞学水平上证实了GSN1参与调控细胞分裂，而不影响细胞伸长。水稻抽穗期FAZ1和gsn1的颖壳橫切以及花药横切显示，FAZ1和gsn1颖壳薄壁细胞和药隔维管束细胞的大小差异不显著，但是gsn1突变体细胞数量明显增加。利用扫描电镜观察成熟颖壳的外表皮和内表皮，FZA1和gsn1外表皮颖壳表面乳突间的距离以及内表皮细胞大小都无差异。另外，利用FAZ1和gsn1两者的幼穗细胞进行流式细胞分析发现，相较于野生型，突变体4C期细胞明显增多。以上这些结果表明，gsn1突变体细胞分裂速率加快，从而导致了更大的器官如图7所示。实施例4GSN1编码一个定位于细胞质的双特异性磷酸酶，第146位丝氨酸突变为苯丙氨酸导致GSN1蛋白失去去磷酸化活性通过在体外分别纯化MBP-GSN1和MBP-GSN1S146F融合蛋白，以化合物OMFP3-o-methylfluoresceinphosphate为底物进行酶活实验发现，融合蛋白MBP-GSN1具有明显的去磷酸化活性，而突变的MBP-GSN1S146F则失去了去磷酸化活性。因此，第146位保守的丝氨酸对于GSN1蛋白完整的生物学功能是非常重要的。另外，分别利用烟草叶片细胞和水稻原生质体研究发现，GSN1蛋白定位于细胞质中。qRT-PCR结果显示，GSN1在各个时期的组织都有表达，但是主要在幼穗期和小穗中有较高的表达如图8所示。实施例5GSN1和OsMPK1特异性发生互作，并且GSN1对OsMPK1进行去磷酸化修饰通过酵母双杂交技术发现GSN1和OsMPK1在体外可以发生互作。然后，利用BiFC双分子荧光互补实验和co-IP免疫共沉淀确认了这个结果。这些体内结果共同显示，GSN1和OsMPK1确实可以发生互作。为了研究GSN1和OsMPK1互作后是否可以对OsMPK1发生去磷酸化修饰，分别表达了融合蛋白MBP-GSN1、MBP-GSN1S146F、GST-OsMPK1和组成型激活的MBP-MKK4CAT238D和S244D，进行体外磷酸化和去磷酸化实验。结果表明，融合蛋白MBP-OsMKK4CA可以对GST-OsMPK1进行磷酸化修饰，接着磷酸化的GST-OsMPK1又可以被MBP-GSN1去磷酸化。然而，MBP-GSN1S146F却不能对已发生磷酸化的GST-OsMPK1进行去磷酸化修饰，这和本发明的预期是一致的。利用特异性磷酸化抗体phos-p4244和质谱检测发现，磷酸化和去磷酸化都发生在GST-OsMPK1的激活环TEYmotif上如图9所示。实施例6水稻OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1级联反应通路参与每穗粒数以及粒重粒型大小的发育与平衡目前水稻中参与发育过程的完整MAPK级联还没有被报道，在野生型FAZ1背景下通过CRISPRCas9基因敲除技术分别敲除OsMKKK10和OsMKK4发现，两者有着极其相似的表型，都表现为：水稻穗型变得紧凑、每穗粒数增多以及粒型变小粒重减少。利用CRISPRCas9技术敲除OsMPK1后虽然是致死的，但是通过RNAi技术干扰OsMPK1的表达发现，OsMPK1被抑制被下调表达的转基因株系其每穗粒数增多，粒型减小，与CRISPRCas9基因敲除OsMKKK10和OsMKK4在表型上具有明显的一致性。另外，在FAZ1背景下过表达组成型激活的OsMKK4CAT238D和S244D，发现其籽粒变大粒重增加，每穗粒数减少。因此，本发明的研究表明，OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1级联反应通路通过参与每穗粒数和粒型大小粒重的发育来控制水稻穗型的发育如图10所示。实施例7GSN1是水稻OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1级联反应通路的负调控因子gsn1突变体表现为稀穗粒数减少和大粒，而抑制OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1级联反应通路组分各自都表现为密穗粒数增加和小粒。因此，本发明在gsn1突变体背景下分别引入突变或者受抑制的级联组分，发现抑制OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1级联组分都可以回复gsn1的表型。这些研究表明，gsn1突变体的表型依赖于OsMKKK10-OsMKK4-OsMPK1级联组分的激活。因此，GSN1是该级联信号通路的负调控因子如图10所示。实施例8拟南芥实验在本实施例中，考虑到GSN1的功能保守性，把水稻GSN1基因在十字花科植物拟南芥中进行了过量表达，以了解该基因在拟南芥中的遗传功能，为GSN1在其它物种中的应用提供了依据。结果如图11所示，结果表明：在拟南芥中过表达来源于水稻的野生型GSN1，导致拟南芥分枝增多；以及导致长角果缩短。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表中国科学院上海生命科学研究院控制植物粒数和粒重的GSN1基因、编码蛋白及其应用P2018-000754PatentInversion3.512295DNAOryzasativa1atggccacgcccgacgacggcggagggggtgtcggcggcggcgcggggaagaagttctgg60cgctccgcgtcgtggtccgcctcccgggacacgccgcccgatgcggcgacgcctgcgggg120gcgggcggcggcggcggcgcgggggcagggcaggcgcgccgcatcccgccgccgccgcct180ctgaccccgcgcggcgggaaggggcggtcctgcctcccgccgctgcagccgctcaacatc240acccgccggagcctcgacgagtggccgcgggcgggctccgacgacgtgggcgagtggccc300aacccgaccacccccggcgcctccaaggcggaaggcgccggctcggccaagcccggggag360ggcctccgcttggacctctcatccctccggtcgcagggtcgcaaagaccagatcgccttc420ttcgacaaggagtgctccaaggttgctgaccacgtctaccttggaggcgacgccgttgcc480aagaaccgcgacatcctgcgcaagaacgggatcacccacgtgctcaattgcgtcggcttc540gtttgtcccgagtact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权利要求：1.一种物质的用途，所述物质为GSN1基因或其编码蛋白、或其突变蛋白、或其促进剂或抑制剂，其特征在于，用于调控植物的性状或用于制备调控植物的性状的组合物，所述性状包括选自下组的一种或多种性状：i粒型；ii穗粒数；iii结实率。2.一种物质的用途，所述物质为GSN1基因或其编码蛋白、活性增强的GSN1突变蛋白、或其促进剂，其特征在于，调控植物的性状或用于制备调控植物的性状的组合物，其中所述性状包括选自下组的一种或多种性状：i缩小粒型；ii增加穗粒数；iii增加结实率。3.一种物质的用途，所述物质为GSN1突变蛋白、或其抑制剂，所述的突变蛋白为与野生型GSN1蛋白相比活性下降的GSN1突变蛋白，其特征在于，用于调控植物的以下一种或多种性状：i增大粒型；ii减少穗粒数；iii减少结实率。4.一种改良植物性状的方法，其特征在于，包括步骤：i调节所述植物中GSN1蛋白的表达量和或活性，从而改良植物性状。5.一种对MPK1蛋白进行去磷酸化的方法，其特征在于，包括步骤：将GSN1蛋白与MPK1蛋白接触，从而对MPK1蛋白进行去磷酸化。6.一种分离的突变型GSN1蛋白，其特征在于，所述突变型GSN1蛋白为非天然蛋白，且所述突变型GSN1蛋白具有调控植物性状的活性，所述性状选自下组的一种或多种性状：i粒型；ii穗粒数；iii结实率。7.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求6所述的突变型GSN1蛋白。8.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求7所述的多核苷酸。9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求8所述的载体，或其基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。10.一种产生权利要求6所述的突变型GSN1蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：在适合表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞，从而表达出突变型GSN1蛋白；和分离所述突变型GSN1蛋白。11.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求6所述的突变型GSN1蛋白。12.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，包括步骤：将编码权利要求6所述蛋白的多核苷酸导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。13.一种鉴定大粒型或小粒型植物的方法，其特征在于，包括步骤：i鉴定植物样本是否具有SEQIDNO.:2或3所示氨基酸序列的多肽或其编码基因；如具有SEQIDNO.:2所示氨基酸序列的多肽或其编码基因，则为小粒型植物，如具有由SEQIDNO.:3所示氨基酸序列的多肽或其编码基因，则为大粒型植物。

百度查询： 中国科学院上海生命科学研究院 控制植物粒数和粒重的GSN1基因、编码蛋白及其应用