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申请/专利权人：郭政

摘要：本发明属于医药技术领域，提供了UFP‑101在抑制心肌细胞β1受体外化和在制备治疗心律失常药物中的应用，UFP‑101预处理能够显著降低大鼠急性心肌缺血早期心律失常的发生，从而确定了UFP‑101在制备治疗心律失常药物中的应用。本发明经实验，结果显示UFP‑101能够显著降低缺血区心肌细胞膜β1受体的表达，产生抑制β1受体过度激活作用，因而能够显著降低大鼠急性心肌缺血早期心律失常的发生。另外实验结果显示UFP‑101对心率不产生影响；对血流动力学的影响较小。

主权项：1.UFP‑101在在抑制心肌细胞β1受体外化中的应用。

全文数据：UFP-101在抑制心肌细胞β1受体外化和在制备治疗心律失常药物中的应用技术领域本发明属于医药技术领域，具体涉及UFP-101在抑制心肌细胞β1受体外化和在制备治疗心律失常药物中的应用。背景技术急性心肌梗死后出现严重的缺血性心律失常，包括室性早搏、室性心动过速以及心室颤动等，是引起心源性猝死的重要原因。急性心肌梗死早期伴随交感神经和心脏感觉神经的过度激活，交感神经过度激活一方面可通过释放大量儿茶酚胺作用于心肌细胞β1受体，另一方面可诱导心肌细胞β1受体出现外化，二者共同引起电生理紊乱并导致各种缺血性心律失常发生。与此同时，有研究表明心脏感觉神经激活能够释放大量感觉神经肽包括降钙素基因相关肽、P物质以及孤啡肽等。已经有多项研究证实急性心肌梗死早期，交感神经释放的神经介质与心脏感觉神经所释放的多种神经肽存在相互作用，共同调节心肌损伤以及心律失常参考文献：WangLL，HanY，GuoZ，etal.Esmololactivatesendogenousneurokininactivityinhibitinginfarction-inducedarrhythmiasinrats：novelmechanismsofanti-arrhythmia［J］.RegulPept，2013，186：116-122.。孤啡肽是一种由17个氨基酸组成的神经肽，其受体NOP与经典阿片受体具有较高的同源性，但孤啡肽受体信号通路介导的生物学效应与经典阿片受体系统功能大有不同。孤啡肽及其受体广泛分布于全身多个系统、器官和组织，对于疼痛、抑郁以及免疫应答等多种病理生理反应具有调节作用。关于孤啡肽与心血管系统之间的关系，动物实验表明急性心肌缺血可引起心肌、脊髓和胸段背根神经节孤啡肽表达显著增多并且在自发性心绞痛患者的血浆中检测到孤啡肽含量显著升高。而在动物实验中通过将外源性孤啡肽静脉或者侧脑室进行给药时，出现了心率和血压的下降。目前尚不能明确病理条件下产生的内源性孤啡肽与外源性给予的孤啡肽是否具有相同的作用，但是能够肯定孤啡肽受体信号通路与心血管系统之间具有密切的联系。并且我们进一步的研究表明急性心肌缺血后过度释放的内源性孤啡肽能够诱导缺血性心律失常发生参考文献：HanY，GuoZ，WangLL，etal.AntagonismofendogenousnociceptinorphaninFQinhibitsinfarction-associatedventriculararrhythmiasviaPKC-dependentmechanisminrats［J］.BrJPharmacol，2013，170（3）：614-623.。UFP-101[N-BnGly-Gly-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-Arg-Lys-Asn-Gln-NH2]是一种特异性的孤啡肽受体拮抗剂，近年来，被广泛应用于研究孤啡肽受体信号通路的各种生物学作用。鉴于孤啡肽受体信号通路在急性心肌缺血过程发挥的作用，使得UFP-101作为缺血性心律失常的潜在治疗手段成为可能。发明内容本发明提供了UFP-101在抑制心肌细胞β1受体外化和在制备治疗心律失常药物中的应用，UFP-101预处理能够显著降低大鼠急性心肌缺血早期心律失常的发生，从而确定了UFP-101在制备治疗心律失常药物中的应用。所述的心律失常为急性心肌缺血诱导的室性心律失常，包括室性早搏、室性心动过速以及心室颤动。本发明经实验，结果显示UFP-101能够显著降低缺血区心肌细胞膜β1受体的表达，产生抑制β1受体过度激活作用，因而能够显著降低大鼠急性心肌缺血早期心律失常的发生。另外实验结果显示UFP-101对心率不产生影响；对血流动力学的影响较小；临床上，抑制β1受体信号通路能够导致心率和血压的下降，对血流动力学有较大的剂量依赖性影响，Ⅱ类抗心律失常药物即β肾上腺素受体阻滞剂在发挥抗心律失常的同时也会引起心率减慢以及血流动力学变化，而本发明实验结果表明UFP-101虽然也是通过降低细胞膜β1受体的含量进而抑制β1受体通路的过度激活发挥抗缺血性心律失常作用，但是并没有观察到其对心率有影响，对于心功能的其他指标影响也较轻微。目前临床上使用的抗心律失常药物主要分为以下四类：Ⅰ类：钠通道阻滞药；Ⅱ类：β肾上腺素受体阻滞剂；Ⅲ类：延长动作电位时程药；Ⅳ类：钙通道阻滞剂。进一步研究发现UFP-101的作用类似于Ⅱ类抗心律失常药物即β肾上腺素受体阻滞剂，主要体现在其能够抑制急性心肌缺血导致的细胞膜β1受体增多，进而抑制β1受体过度激活发挥抑制缺血性心律失常作用。但是，UFP-101对于心率以及血流动力学的影响则与β肾上腺素受体阻滞剂不完全相同，在实验中，并未观察到UFP-101对心率有显著影响。UFP-101和β肾上腺素受体阻滞剂均能够抑制急性心肌缺血早期β1受体通路的过度激活然后发挥抗缺血性心律失常作用，但是β肾上腺素受体阻滞剂却能够通过抑制β1受体通路降低心率、减少心输出量，对于血流动力学以及心功能有较大的抑制作用。但是本实验剂量浓度下的UFP-101对于心率无影响，对于心功能的其他指标（如LVSP和LVEDP）存在短暂的抑制作用，同β肾上腺素受体阻滞剂存在明显的区别。附图说明图1为UFP-101对大鼠心肌缺血前后不同时间段心功能各指标的数据分析图；图2为UFP-101对大鼠心肌缺血后不同时间段心功能各指标与缺血前（基线水平）相比的百分比变化数据统计图，注：与CAO组比较，*P0.05。图3为UFP-101对大鼠心肌缺血后细胞膜及全细胞组分β1受体表达的影响结果图；图中：A-B：Western-Blot条带图；C：Western-Blot统计图，注：与Sham组比较，aP0.05,与U+CAO组比较，bP0.05。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1：急性心肌缺血模型的建立以及分组实验材料和设备：本发明所采用的化合物UFP-101CAS:849024-68-6乃商务采购所得；膜蛋白提取试剂盒：Invent公司；兔抗大鼠β1-AR、NaK-ATPase、GAPDH一抗以及羊抗兔HRP-IgG二抗：英国Abcam公司；AlC-V8小动物呼吸机：上海澳尔科特公司；RM6240BD电生理信号记录仪：成都仪器厂。实验动物：实验动物选用清洁级雄性SD大鼠60只，250-280g，购自解放军军事科学研究院实验动物中心，许可证号：SCXK（军）2012-0004，6～8周龄，适应性喂养1周。动物实验经山西医科大学伦理委员会批准。实验动物分组：采用随机数字表法分为3组（n=10）：假手术组（Sham组）、结扎左冠状动脉前降支（冠脉）组（CAO组）和孤啡肽受体拮抗剂（UFP-101）预处理组（U+CAO组）。Sham组仅开胸穿线但不结扎冠脉；CAO组开胸后结扎左冠状动脉前降支；U+CAO组在结扎冠脉前10min经尾静脉按1mLkg注射特异性孤啡肽受体拮抗剂UFP-101（1×10-9molL），其余2组给予等容量生理盐水。建立大鼠急性心肌缺血模型：大鼠称质量后以质量分数为25%的乌拉坦（1.2gkg）进行腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧位固定于操作台上连接生物信号采集系统记录标准Ⅱ导联心电图，并经右侧颈内静脉置入信号采集导管至左心室。气管切开置入气管导管，连接小动物呼吸机施行机械通气，呼吸机潮气量设为8mLkg，呼吸频率70次min。稳定15min后，按1mLkg经尾静脉分别注入生理盐水或UFP-101。10min后在左侧第四肋间隙开胸，以5-0无损伤缝线的弯针从左心耳右缘进针，肺动脉圆锥左缘出针结扎左冠状动脉前降支。而后可见Ⅱ导联心电图出现ST段逐渐抬高并渐与QRS波融合，心肌前壁组织变苍白色随后出现紫绀，可有心律失常出现，提示造模成功。实施例2：心律失常数据的采集分析以及评分将各组大鼠冠脉结扎后1h内心律失常进行计数和分析并对心律失常进行评分参考文献：MillerLE，HosickPA，WriedenJ，etal.Evaluationofarrhythmiascoringsystemsandexercise-inducedcardioprotection［J］.MedSciSportsExerc，2012，44（3）：435-441.，具体评分标准如下：0分，冠脉结扎后1h内共出现＜50个室早（ventricularectopicbeats，VEB），包括单发室早、室早二联律、室早三联律。1分，出现≥50个VEB。2分，出现1~5次室速（ventriculartachycardia，VT）。3分，出现≥6次VT。4分，出现1次室颤（ventricularfibrillation，VF）。5分，出现2~5次VF。心功能的记录和分析：将体现大鼠心功能的5个指标leftventricularsystolicpressureLVSP、leftventricularenddiastolicpressureLVEDP、heartrateHR、LV+dpdtmax和LV-dpdtmax进行记录，以冠脉结扎前15min以及冠脉结扎后1-15min、16-30min、31-45min和46-60min共5个时间段数据进行比较和分析。心律失常结果：UFP-101预处理能够显著降低大鼠缺血性心律失常发生，VEB次数、VT+VF持续时间及心律失常评分明显下降P0.05或P0.017，见表1。表1：3组大鼠冠脉闭塞后1h内累计心律失常的比较（n=10）＊＊P0.01；a与Sham组比较，b与U+CAO组比较，P0.05；A与Sham组比较，B与U+CAO组比较，P0.017表1结果提示大鼠急性心肌缺血早期（1h内）可出现严重的缺血性心律失常包括VEB、VT以及VF，而UFP-101能够显著减少VEB发生次数，减少VT+VF持续时间并降低心律失常评分,有效的抑制了急性心肌缺血早期缺血性心律失常的发生。心功能结果：实验结果见图1和2，冠脉结扎后1-15min，U+CAO组大鼠LVSP下降P0.05，LVEDP上升P0.05，其余指标则无统计学意义，表明UFP-101对心率无影响，对于心流动力学的影响也较小，提示同样是通过抑制β1受体通路的激活，β受体阻滞剂在临床以及动物实验被公认为对心率以及血流动力学影响较大，而当UFP-101以1×10-9molL按1mLkg静脉给药时能够显著抑制缺血性心律失常，但对心率无影响，对血流动力学影响较小。实施例3：Western-Blot：利用膜蛋白提取试剂盒处理提取组织膜蛋白，加入裂解液，分装-80℃保存。另外，称取部分组织按正常步骤提取总蛋白，分装-80℃保存。将分装蛋白利用BCA法进行蛋白定量，依次进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭2h后，加入β1-AR一抗（稀释浓度为1:1000）摇匀后4℃孵育，摇床过夜，加入二抗室温孵育1h。TBST清洗，3次×10min。应用QuantityOne图像分析软件测定各蛋白条带的灰度值。细胞膜组分中，以β1-AR条带灰度值与内参NaK-ATPase灰度值的比值反映其表达水平；全细胞组分中，以β1-AR条带灰度值与内参GAPDH灰度值的比值反映其表达水平。统计学方法：应用SPSS13.0软件进行统计分析，正态分布计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。非正态分布计量资料以M（P25,P75）表示，采用Kruskal-WallisH检验，组内两两比较采用Mann-WhitneyU检验，并对检验水准α'按Bonferroni法进行校正。Western-Blot结果：实验结果见图3，给予UFP-101后，与单纯结扎组CAO组相比，冠脉结扎后细胞膜β1受体表达显著降低P0.05。本结果提示UFP-101能够通过降低急性心肌缺血后心肌细胞膜β1受体的表达，抑制β1受体的过度激活发挥抗缺血性心律失常作用。本实验的UFP-101预处理即是在心肌缺血前10min也就是冠状动脉闭塞（CAO）前10min经大鼠尾静脉注射给药，研究表明UFP-101抑制大鼠缺血性心律失常的作用机制可能与降低急性心肌缺血后细胞膜β1受体表达进而抑制β1受体的过度激活有关。

权利要求：1.UFP-101在在抑制心肌细胞β1受体外化中的应用。2.UFP-101在制备治疗心律失常药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其中所述的心律失常为急性心肌缺血诱导的室性心律失常，包括室性早搏、室性心动过速以及心室颤动。4.根据权利要求2所述的应用，所述UFP-101采用静脉注射给药，UFP-101浓度为1×10-9molL，给药剂量为1mLkg。

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