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申请/专利权人：中山大学

摘要：本发明公开了一种藁杆双脐螺的分子鉴定方法，包括如下步骤：S1.提取待测样品总DNA；S2.以步骤S1总DNA为模板，分别扩增其COI基因和16S rDNA基因；S3.对步骤S2的扩增产物进行测序，与藁杆双脐螺及扁蜷螺的COI基因和16S rDNA基因进行序列比对并构建进化树，计算物种间遗传距离，根据进化树聚类关系以及遗传距离鉴定藁杆双脐螺。与传统的鉴定方法相比，本发明提供的检测引物、特异基因序列及建立的藁杆双脐螺鉴定方法可有效实现藁杆双脐螺的快速鉴定，缩短鉴定时间，具有较大的应用前景。

主权项：1.一种藁杆双脐螺的分子鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.提取待测样品总DNA；S2.以步骤S1总DNA为模板，分别扩增其COI基因和16S rDNA基因；S3.对步骤S2的扩增产物进行测序，与藁杆双脐螺和扁蜷螺的COI基因和16S rDNA基因进行序列比对并构建进化树，计算物种间遗传距离；根据进化树聚类关系以及遗传距离鉴定藁杆双脐螺。

全文数据：一种藁杆双脐螺的分子鉴定方法技术领域本发明属于分子生物技术领域，更具体地，涉及一种区分藁杆双脐螺与几种扁蜷螺的分子鉴定方法。背景技术扁蜷螺Planorbidae隶属于软体动物门，与医学关系密切，是一种严重危害人体健康的寄生虫主要传播媒介。常见的扁卷螺种类主要有大脐圆扁螺Hippeutisumbilicalis、凸旋螺Gyraulusconvexiusculus、小旋螺Gyraulusparvus，以及藁杆双脐螺Biomphalariastraminea。藁杆双脐螺是曼氏血吸虫的中间宿主之一，近十几年来，由于人口迁移和货物频繁运输，其作为外来物种已在我国深圳地区形成淡水螺类优势种群。作为血吸虫病的媒介传播动物，藁杆双脐螺已引起中国疾病预防控制部门的高度重视。目前，对藁杆双脐螺与其它扁蜷螺的鉴定主要依靠分类学家通过识别外部形态学特征或解剖学特征来实现例如：周幼杨,谢广龙,周春花,etal.曼氏血吸虫宿主藁杆双脐螺与几种扁蜷螺形态解剖学比较[J].海洋科学,201711.，但由于外部形态具有高度可塑性，易受环境的影响，仅仅依据外部特征对其分类和鉴定不够准确。因此，亟需一种快速准确的鉴别方法，以弥补传统分类方法的缺陷。以聚合酶链式反应PCR技术为基础的DNA测序方法与传统的分类鉴别方法相比，简单易行，周期短，准确度高，在物种的分类鉴定中得到广泛使用；高世同等2016公开了基于线粒体16SrDNA序列的深圳水库区双脐螺分子鉴定高世同,李晓恒,耿艺介,etal.基于线粒体16SrDNA序列的深圳水库区双脐螺分子鉴定[J].中华地方病学杂志,2016,359:636-639.。目前还未见有通过分子生物学手段鉴别藁杆双脐螺与几种扁蜷螺的方法。发明内容本发明所要解决的技术问题是针对现有藁杆双脐螺与几种扁蜷螺难以通过形态学区分的缺陷和不足，提供一种去区分藁杆双脐螺与几种扁蜷螺的分子鉴定方法。本发明的第一个目的是提供一种藁杆双脐螺的分子鉴定方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种藁杆双脐螺的分子鉴定方法，包括如下步骤：S1.提取待测样本总DNA；S2.以步骤S1总DNA为模板，分别扩增其COI基因和16SrDNA基因；S3.对步骤S2的扩增产物进行测序，与藁杆双脐螺及扁蜷螺的COI基因和16SrDNA基因进行序列比对并构建进化树，计算物种间遗传距离；根据进化树聚类关系以及遗传距离鉴定藁杆双脐螺。优选地，所述扁蜷螺为大脐圆扁螺、凸旋螺或小旋螺中的一种或多种。优选地，所述COI基因的PCR扩增引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示。优选地，所述16SrDNA基因的PCR扩增引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：3～4所示。优选地，所述藁杆双脐螺的COI基因的核苷酸序列如KF926188所示或与所示序列具有至少99％序列同源性的序列。优选地，所述大脐圆扁螺、凸旋螺及小旋螺的COI基因的核苷酸序列分别如KC135955、KC495830、KM206703所示，或与所示序列具有至少99％序列同源性的序列。优选地，所述藁杆双脐螺的16SrDNA基因的核苷酸序列如KY697223或AY030213所示，或与所示序列具有至少99％序列同源性的序列。优选地，所述大脐圆扁螺、凸旋螺及小旋螺的16SrDNA基因的核苷酸序列如KC495948所示，或与所示序列具有至少99％序列同源性的序列。优选地，所述COI基因的PCR扩增反应体系为50μL反应体系：50ngDNA，20μM引物，45μLPCRMix；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，45℃退火30s，72℃延伸15s，共28个循环；72℃延伸3min。优选地，所述16SrDNA基因的PCR扩增反应体系为50μL反应体系：50ngDNA，20μM引物，45μLPCRMix；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。作为一种优选地可实施方式，所述藁杆双脐螺的分子鉴定方法，包括如下步骤：1收集扁蜷螺待测样本：采集的样本浸泡于95％乙醇，4℃保存；2基因组DNA提取：采用DNeasyBlood&TissueKitQiagen,Hilden,Germany剂盒提取样本DNA，提取出的DNA样品-20℃保存；3以步骤2的基因组DNA为模板，用SEQIDNO：1～2所示引物进行PCR扩增反应；PCR扩增反应体系为50μL反应体系：50ngDNA，20μM引物，45μLPCRMix；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，45℃退火30s，72℃延伸15s，共28个循环；72℃延伸3min；4以步骤2的基因组DNA为模板，用SEQIDNO：3～4所示引物进行PCR扩增反应；PCR扩增反应体系为50μL反应体系：50ngDNA，20μM引物，45μLPCRMix；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；5扩增出的产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。利用Takara切胶回收试剂盒回收PCR产物，产物与pClone007BluntSimpleVectorKit载体连接，挑阳性克隆摇菌送擎科生物测序。6先利用chromas软件读取测序的序列，观察峰形进行校对，运用ClustalX软件对测得的序列与所示的序列进行多序列同源性比对；运用MEGA6.0构建进化树，计算物种间遗传距离。当待测样本的COI基因与KF926188，或16SrDNA基因与KY697223或AY030213相似度高达99％以上的即可认为该待测样本为藁杆双脐螺。或者当待测样本的COI基因与KF926188的遗传距离，或16SrDNA基因与KY697223或AY030213的遗传距离小于0.005时，即可认为该待测样本为藁杆双脐螺。优选地，当待测样本的COI基因与KF926188及16SrDNA基因与KY697223或AY030213相似度高达99％以上的可认为该待测样本为藁杆双脐螺。或者当待测样本的COI基因与KF926188的遗传距离及16SrDNA基因与KY697223或AY030213的遗传距离小于0.005时，即可认为该待测样本为藁杆双脐螺。本发明还请求保护上述任一项所述方法在快速区分鉴别藁杆双脐螺或在制备藁杆双脐螺检测、鉴定试剂盒中的应用。本发明还提供一种藁杆双脐螺检测、鉴定试剂盒，所述试剂盒包含SEQIDNO：1～2和SEQIDNO：3～4所示PCR扩增引物。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种藁杆双脐螺的分子鉴定方法，与传统的鉴定方法相比，本发明提供的检测引物、特异基因序列及建立的藁杆双脐螺鉴定方法可有效实现藁杆双脐螺的快速鉴定，缩短鉴定时间。附图说明图1为藁杆双脐螺与几种扁蜷螺COI基因PCR扩增结果电泳鉴定图；1-Biomphalariastraminea藁杆双脐螺；2-Hippeutisumbilicalis大脐圆扁螺；3-Gyraulusconvexiusculus凸旋螺；4-GyraulusParvus小旋螺。图2为藁杆双脐螺与几种扁蜷螺16SrDNA基因PCR扩增结果电泳鉴定图；1-Biomphalariastraminea藁杆双脐螺；2-Hippeutisumbilicalis大脐圆扁螺；3-Gyraulusconvexiusculus凸旋螺；4-GyraulusParvus小旋螺。图3为藁杆双脐螺与几种扁蜷螺COI基因的同源序列比对情况。图4为藁杆双脐螺与几种扁蜷螺16SrDNA基因的同源序列比对情况。图5为基于藁杆双脐螺与几种扁蜷螺COI基因构建的进化树。图6为基于藁杆双脐螺与几种扁蜷螺6SrDNA基因构建的进化树。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1一、方法1、供试样本藁杆双脐螺标本于2017年9～12月采自广东省深圳市大沙河；大脐圆扁螺、凸旋螺、小旋螺分别于2016年10～11月，采自江西省南昌市修水县和武宁县的稻田以及溪流。扁蜷螺种类鉴定经专家依据形态学特征实现，保证结果可靠性。2、序列信息登陆美国国家生物技术信息中心NCBI，https:www.ncbi.nlm.nih.gov，下载已有的藁杆双脐螺与几种扁蜷螺相似度较高的COI序列Biomphalariastraminea：KF926188，Brazil；Gyraulussp.：KC495830；Gyraulushuwaizahensis：KM206703；Hippeutiscantori：KC135955。登陆美国国家生物技术信息中心NCBI，https:www.ncbi.nlm.nih.gov，下载已有的藁杆双脐螺与几种扁蜷螺相似度较高的16SrDNA序列Biomphalariastraminea：KY697223，HK；Biomphalariastraminea：AY030213，Brazil；Planorbellatrivolvis：AY030234；Gyraulussp.：KC495948。3、方法1使用DNeasyBlood&TissueKitQiagen,Hilden,Germany试剂盒提取供试样本DNA，并稀释为50ngμL的工作液备用，提取出的DNA样品-20℃保存。2使用COI与16SrDNA通用引物扩增藁杆双脐螺与几种扁蜷螺目的基因片段。其中所述PCR扩增引物和PCR反应体系、程序如下所示：COI通用引物序列为：COI-F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'SEQIDNO：1；COI-R：5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'SEQIDNO：2；16SrDNA通用引物为：16Sar：5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3'SEQIDNO：3；16Sbr：5'-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3'SEQIDNO：4；COI基因的PCR扩增反应体系为50μL反应体系：50ngDNA，20μM引物，45μL金牌Mix；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，45℃退火30s，72℃延伸15s，共28个循环；72℃延伸3min；16SrDNA基因的PCR反应体系50μL：50ngDNA，20μM引物，45μL金牌Mix；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；所述金牌Mix的生产厂家为北京擎科新业生物技术有限公司，货号TSE101，规格5×1.125mL。3扩增出的产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测。利用Takara切胶回收试剂盒回收PCR产物，产物与pClone007BluntSimpleVectorKit载体连接，挑阳性克隆摇菌送擎科生物测序。4测序所得序列用Chromas读取，观察峰值进行校对，在美国国家生物技术信息中心NCBI上进行Blastn多重比对分析，确定所得序列为藁杆双脐螺与几种扁蜷螺基因序列。5利用ClustalX对测得的序列进行多序列比对。6运用MEGA6.0软件，以邻接法构建进化树，计算物种间遗传距离。二、结果1通过选用的COI通用引物及16SrDNA通用引物扩增得到的产物的电泳图如图1、图2所示，COI引物扩增产物片段长度约700bp，选用的16SrDNA通用引物扩增产物片段长度约500bp。2藁杆双脐螺与几种扁蜷螺COI基因测序获得的序列信息如SEQIDNO：5～8所示：Biomphalariastraminea藁杆双脐螺SEQIDNO：5GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGTACCTTGTATATAGTTTTTGGAATTTGATGTGGTCTAGTTGGAACTGGATTATCATTATTAATTCGTTTAGAACTTGGTACAACTCTTGTTTTGATAGATGAACACTTTTATAATGTTATTGTTACTGCTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAGTTATACCTATAATAATTGGTGGATTTGGAAACTGAATAGTTCCTTTATTAATTGGTGCTCCAGATATAAGATTTCCTCGAATAAATAATATATCTTTTTGACTTCTTCCTCCTTCATTTATTTTACTATTAGTATCTAGAATAGTTGAAGGTGGGGTAGGAACAGGTTGAACTGTTTACCCTCCTCTGAGTGGACCTATTGCTCATGGTGGTGCATCTGTAGACTTGGCTATTTTTTCTTTACATTTAGCAGGAATAAGTTCTATTTTAGGTGCTATTAATTTTATTACTACAATTTTTAATATACGAGCTCCTGGAATTACGATGGAACGTTTATCATTATTTGTATGATCTGTATTAGTTACAGCATTTTTATTATTGCTATCTTTACCTGTTTTAGCTGGTGCCATTACTATATTATTGACTGATCGAAATTTTAATACTAGATTTTTTGATCCTGCAGGTGGTGGTGATCCTATTCTTTATCAACATTTATTTTGATTTTTTGGTCACCCTGAAGTTTAHippeutisumbilicalis大脐圆扁螺SEQIDNO：6GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGAACCTTATACTTGATCTTTGGTGTTTGATGTGGGTTAGTTGGTACTGGTCTATCTTTGTTAATTCGTTTAGAATTAGGAACTTCTGGTGTTTTAATGGATGAACATTTTTATAATGTTATTGTTACAGCTCATGCTTTTATTATAATTTTTTTTATAGTTATACCTATAATAATTGGTGGATTTGGGAACTGAATGATTCCGTTGTTAATTGGAGCACCTGATATATCGTTTCCACGTATAAATAATATGTCTTTTTGATTATTACCACCATCATTTGTTTTATTATTGGTGTCTTCTATGGTTGAAGGTGGTGTGGGTACAGGTTGAACTGTTTATCCCCCATTAAGAGGACCTGTTGCACATAGTGGTGCATCAGTTGATTTAGCTATTTTTTCATTACATTTAGCTGGAATGTCTTCTATTTTAGGTGCAATTAACTTTATTACTACAGTTTTTAATATACGAGCACCTGGAATTACTATAGAACGATTATCTTTGTTTGTTTGATCGGTTTTAATTACAGCTTTTTTACTTTTACTTTCTTTACCTGTATTAGCTGGGGCTATTACAATATTGTTAACAGATCGTAATTTTAATACAAGATTTTTTGATCCAGCAGGTGGTGGAGACCCTATTTTATATCAACATTTATTTTGATTTTTTGGTCACCCTGAAGTTTAGyraulusconvexiusculus凸旋螺SEQIDNO：7GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGACACTATACTTAATTTTTGGTGTATGGTGTGGATTAGTAGGGACAGGATTATCTTTATTAATTCGTTTAGAACTTGGAACATCTTTAGTTTTAATAGACGAACATTTTTATAATGTTATTGTTACTGCTCATGCATTTATTATAATTTTTTTTATAGTTATACCTATAATAATTGGTGGATTTGGGAATTGAATAATTCCTTTATTAATTGGTGCACCAGATATATTTTTCCTCGAATAAATAATATATCATTTTGATTATTACCGCCATCGTTTATTTTATTGTTAGTTTCTAGAATAGTAGAAGGAGGTGTAGGAACTGGTTGAACTGTTTACCCACCTTTAAGTAGGACTTTAGGTCATGGGGGTGCATCTGTAGATTTAGCTATTTTTTCATTACATTTAGCTGGAATATCTTCAATTTTAGGGGCTATTAATTTTATTACAACTGTTTTTAACATACGAGCTCCTGGAATTACTATAGAACGGTTATCTTTATTTGTGTGATCTGTTTTAATTACTGCTTTTCTATTATTACTATCTTTACCTGTATTAGCTGGTGCTATTACAATACTACTTACTGACCGAAACTTTAATACTTCTTTTTTTGATCCAGCTGGAGGAGGGGATCCTATTCTTTATCAACATTTATTTTGGTTTTTTGGTCACCCTGAAGTTTAGyraulusparvus小旋螺SEQIDNO：8GGTCAACAAATCATAAAGATATTGGGACACTATACTTAATTTTTGGTGTATGGTGTGGATTAGTAGGGACAGGATTATCTTTATTAATTCGTTTAGAACTTGGAACATCTTTAGTTTTAATAGACGAACATTTTTATAATGTTATTGTTACTGCTCATGCATTTATTATAATTTTTTTTATAGTTATACCTATAATAATTGGTGGATTTGGAAATTGAATAATTCCTTTATTAATTGGTGCACCAGATATATCTTTTCCTCGAATAAATAATATATCATTTTGATTATTACCACCATCATTTATTTTATTGTTAGTTTCTAGAATAGTAGAAGGAGGTGTAGGAACTGGTTGAACTGTTTACCCACCTTTAAGTAGGACTTTAGGACATGGGGGTGCATCTGTAGATTTAGCTATTTTTTCATTACATTTAGCTGGAATATCTTCAATTTTAGGGGCTATTAATTTTATTACAACTGTTTTTAACATACGAGCTCCTGGAATTACTATAGAACGGTTATCTTTATTTGTGTGATCTGTTTTAATTACTGCTTTTTTATTATTACTATCTTTACCTGTATTAGCTGGTGCTATTACAATACTACTTACTGATCGAAACTTTAATACTTCTTTTTTTGATCCAGCTGGAGGAGGGGATCCTATTCTTTATCAACATTTATTTTGGTTTTTTGGTCACCCTGAAGTTT藁杆双脐螺与几种扁蜷螺16SrDNA基因测序获得的序列信息如SEQIDNO：9～12所示：Biomphalariastraminea藁杆双脐螺SEQIDNO：9CGCCTGTTTATCAAAAACATAGTTTAAGGAAATAATCTTAAATGAATTCTGCCCAGTGATTTTTTTTTAAATGGCCGCAGTACCTTGACTGTGCTAAGGTAGCATAATCAATTGGCTTCTAATTAAAGTCTGGAATGAAAGGAAATATGAAGTAATTCTATCTTAAAGGATTTTTTTTGAATTTATTTAAATGATGAAAATATCATTTTATAGAAAAAAGACGAGAAGACCCTTAGAGTTTTGATATTTATATATTTTTGTTGGGGCGACAGGTAAACATATAACTTTACGAATTATCATTGATCGATTTTTTATAAGAATAATAAAACTACCTTAGGGATAACAGCATTATATTTTTTTTTATGATTGTGACCTCGATGTTGGACTAGGAACTTTATGGCTAGCCGTCAAAAAAGATTTGTTCTGTTCGAACAATTTTATCCTACATGATCTGAGTTCAGACCGGHippeutisumbilicalis大脐圆扁螺SEQIDNO：10CGCCTGTTTATCAAAAACATAGTTTTATGAAAAAATATAAAATTCAACCTGCCCAGTGTGTAATTATAAATGGCCGCAGTACCTTGACTGTGCTAAGGTAGCATAATCAATTGGCTTTTAATTAAAGTCTGGAATGAAAGGGAAAATGAAAAATAACTGTCTTAAATATATTATATAAAATTTATTTATCAGGTGCAAATACCTGTATTTTGAATAAAGACGAGAAGACCCTATGAGTTTTAATTAATATTAATCACTGAATTATTTATTTTTTTGTTGGGGCGACATGTTAACATTTTGAACTTAACTTATAATATTTAGCGTAATTGTAAAATGAATTTAAACTACCTTAGGGATAACAGCATAATTTATTTTTAAGTTTGTGACCTCGATGTTGGACTAGGAACTATATGGCTAACCGTTAAATTAGATTTGTTCTGTTCGAACAATATTATCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGGyraulusconvexiusculus凸旋螺SEQIDNO：11CGCCTGTTTATCAAAAACATAGTTTTATGATTATATATAAAATATTTTCTGCCCAGTGTCAGTAGATAAATGGCCGCAGTACCTTGACTGTGCTAAGGTAGCATAATCAATTGGCTTTTAATTGAAGTCTAGAATGAATGGGATAATGGAATTTAGCTGTCTTGATTTTTTTAATAAAAATTTATTTATAAGGTGAAAATACCTTAAATTATAATAAAGACGAGAAGACCCTATGAATTTTTAAATTTTTTGTTGGGGCGACAGTTTAAAAATAAATCTTAAATTTAAAATATATAACGATTTTTTTAATAAAAATTAAATTACCTTAGGGATAACAGCATTATTATTTAAATAGTTTGTGACCTCGATGTTGGACTAGGAACTAAAAGGCTAACCGTCTTTATAGATTTGTTCTGTTCGAACAATTTTATCCTACATGATCTGAGTTCAGACCGG＞Gyraulusparvus小旋螺SEQIDNO：12CGCCTGTTTATCAAAAACATAGTTTTATGATTATATATAAAATATTTTCTGCCCAGTGTCAGTAGATAAATGGCCGCAGTACCTTGACTGTGCTAAGGTAGCATAATCAATTGGCTTTTAATTGGAGTCTAGAATGAATGGGATAATGGAATTTAGCTGTCTTGATTTTTCTAATAAAAATTTATTTATAAGGTGAAAATACCTTAAATTATAATAAAGACGAGAAGACCCTATGAATTTTTAAATTTTTTTGTTGGGGCGACAGTTTAAAATAAAAATCTTAAATTTAAAATATATAACGATTTTTTTAATAAAAATTAAATTACCTTAGGGATAACAGCATTATTATTCAAATAGTTTGTGACCTCGATGTTGGACTAGGAACTAAAAGGCTAACCGTCTTTATAGATTTGTTCTGTTCGAACAATTTTATCCTACATGATCTGAGTTCAGACCGG3藁杆双脐螺与几种扁蜷螺COI基因的同源序列比对情况如图3所示，16SrDNA基因的同源序列比对情况如图4所示。4基于COI基因构建的进化树如图5所示，计算遗传距离，其结果如表1所示：表1基于COI基因的遗传距离B.stramineaH.umbilicalisG.convexiusculusG.parvusKF926188KC135955KC495830KM206703B.stramineaH.umbilicalis0.209G.convexiusculus0.1700.203G.parvus0.1630.1920.010KF9261880.0030.2110.1720.165KC1359550.2040.0150.1940.1790.207KC4958300.1670.2050.0050.0120.1700.192KM2067030.1680.1940.0600.0540.1700.1840.062基于16SrDNA基因构建的进化树如图6所示，计算遗传距离，其结果如表2所示：表2基于16SrDNA基因的遗传距离B.stramineaH.umbilicalisG.convexiusculusG.parvusKY697223AY030213AY030234KC495948B.stramineaH.umbilicalls0.196G.convexiusculus0.2240.166G.parvus0.2340.1760.008KY6972230.0050.2020.2310.242AY0302130.0000.1960.2240.2340.005AY0302340.1060.1560.1860.1890.1120.106KC4959480.2240.1660.0000.0080.2310.2240.186上述结果表明，藁杆双脐螺与几种扁蜷螺的COI和16SrDNA基因PCR扩增产物经测序、多序列比对后构建进化树，根据进化树聚类关系以及遗传距离可以将藁杆双脐螺与几种扁蜷螺加以区分。当待测样本的COI基因与KF926188，或16SrDNA基因与KY697223或AY030213相似度高达99％以上的即可认为该待测样本为藁杆双脐螺。或者当待测样本的COI基因与KF926188的遗传距离，或16SrDNA基因与KY697223或AY030213的遗传距离小于0.005时，即可认为该待测样本为藁杆双脐螺。最好是当待测样本的COI基因与KF926188及16SrDNA基因与KY697223或AY030213相似度高达99％以上的可认为该待测样本为藁杆双脐螺。或者当待测样本的COI基因与KF926188的遗传距离及16SrDNA基因与KY697223或AY030213的遗传距离小于0.005时，即可认为该待测样本为藁杆双脐螺。本发明的藁杆双脐螺与几种扁蜷螺的鉴定方法己经通过具体的实例进行描述。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化来实现相应的目的，但其相关改变均未脱离本发明技术方案的内容，仍属于本发明技术方案的保护范围。序列表中山大学一种藁杆双脐螺的分子鉴定方法YG18108868AA0422018-12-1212SIPOSequenceListing1.0125DNA扁蜷螺Planorbidae1ggtcaacaaatcataaagatattgg25222DNA扁蜷螺Planorbidae2ccggtctgaactcagatcacgt22320DNA扁蜷螺Planorbidae3cgcctgtttatcaaaaacat20422DNA扁蜷螺Planorbidae4ccggtctgaactcagatcacgt225706DNA藁杆双脐螺Biomphalariastraminea5ggtcaacaaatcataaagatattggtaccttgtatatagtttttggaatttgatgtggtc60tagttggaactggattatcattattaattcgtttagaacttggtacaactcttgttttga120tagatgaacacttttataatgttattgttactgctcatgcttttattataatttttttta180tagttatacctataataattggtggatttggaaactgaatagttcctttattaattggtg240ctccagatataagatttcctcgaataaataatatatctttttgacttcttcctccttcat300ttattttactattagtatctagaatagttgaaggtggggtaggaacaggttgaactgttt360accctcctctgagtggacctattgctcatggtggtgcatctgtagacttggctatttttt420ctttacatttagcaggaataagttctattttaggtgctattaattttattactacaattt480ttaatatacgagctcctggaattacgatggaacgtttatcattatttgtatgatctgtat540tagttacagcatttttattattgctatctttacctgttttagctggtgccattactatat600tattgactgatcgaaattttaatactagattttttgatcctgcaggtggtggtgatccta660ttctttatcaacatttattttgattttttggtcaccctgaagttta7066706DNA大脐圆扁螺Hippeutisumbilicalis6ggtcaacaaatcataaagatattggaaccttatacttgatctttggtgtttgatgtgggt60tagttggtactggtctatctttgttaattcgtttagaattaggaacttctggtgttttaa120tggatgaacatttttataatgttattgttacagctcatgcttttattataatttttttta180tagttatacctataataattggtggatttgggaactgaatgattccgttgttaattggag240cacctgatatatcgtttccacgtataaataatatgtctttttgattattaccaccatcat300ttgttttattattggtgtcttctatggttgaaggtggtgtgggtacaggttgaactgttt360atcccccattaagaggacctgttgcacatagtggtgcatcagttgatttagctatttttt420cattacatttagctggaatgtcttctattttaggtgcaattaactttattactacagttt480ttaatatacgagcacctggaattactatagaacgattatctttgtttgtttgatcggttt540taattacagcttttttacttttactttctttacctgtattagctggggctattacaatat600tgttaacagatcgtaattttaatacaagattttttgatccagcaggtggtggagacccta660ttttatatcaacatttattttgattttttggtcaccctgaagttta7067705DNA凸旋螺Gyraulusconvexiusculus7ggtcaacaaatcataaagatattgggacactatacttaatttttggtgtatggtgtggat60tagtagggacaggattatctttattaattcgtttagaacttggaacatctttagttttaa120tagacgaacatttttataatgttattgttactgctcatgcatttattataatttttttta180tagttatacctataataattggtggatttgggaattgaataattcctttattaattggtg240caccagatatatttttcctcgaataaataatatatcattttgattattaccgccatcgtt300tattttattgttagtttctagaatagtagaaggaggtgtaggaactggttgaactgttta360cccacctttaagtaggactttaggtcatgggggtgcatctgtagatttagctattttttc420attacatttagctggaatatcttcaattttaggggctattaattttattacaactgtttt480taacatacgagctcctggaattactatagaacggttatctttatttgtgtgatctgtttt540aattactgcttttctattattactatctttacctgtattagctggtgctattacaatact600acttactgaccgaaactttaatacttctttttttgatccagctggaggaggggatcctat660tctttatcaacatttattttggttttttggtcaccctgaagttta7058705DNA小旋螺Gyraulusparvus8ggtcaacaaatcataaagatattgggacactatacttaatttttggtgtatggtgtggat60tagtagggacaggattatctttattaattcgtttagaacttggaacatctttagttttaa120tagacgaacatttttataatgttattgttactgctcatgcatttattataatttttttta180tagttatacctataataattggtggatttggaaattgaataattcctttattaattggtg240caccagatatatcttttcctcgaataaataatatatcattttgattattaccaccatcat300ttattttattgttagtttctagaatagtagaaggaggtgtaggaactggttgaactgttt360acccacctttaagtaggactttaggacatgggggtgcatctgtagatttagctatttttt420cattacatttagctggaatatcttcaattttaggggctattaattttattacaactgttt480ttaacatacgagctcctggaattactatagaacggttatctttatttgtgtgatctgttt540taattactgcttttttattattactatctttacctgtattagctggtgctattacaatac600tacttactgatcgaaactttaatacttctttttttgatccagctggaggaggggatccta660ttctttatcaacatttattttggttttttggtcaccctgaagttt7059466DNA藁杆双脐螺Biomphalariastraminea9cgcctgtttatcaaaaacatagtttaaggaaataatcttaaatgaattctgcccagtgat60ttttttttaaatggccgcagtaccttgactgtgctaaggtagcataatcaattggcttct120aattaaagtctggaatgaaaggaaatatgaagtaattctatcttaaaggattttttttga180atttatttaaatgatgaaaatatcattttatagaaaaaagacgagaagacccttagagtt240ttgatatttatatatttttgttggggcgacaggtaaacatataactttacgaattatcat300tgatcgattttttataagaataataaaactaccttagggataacagcattatattttttt360ttatgattgtgacctcgatgttggactaggaactttatggctagccgtcaaaaaagattt420gttctgttcgaacaattttatcctacatgatctgagttcagaccgg46610480DNA大脐圆扁螺Hippeutisumbilicalis10cgcctgtttatcaaaaacatagttttatgaaaaaatataaaattcaacctgcccagtgtg60taattataaatggccgcagtaccttgactgtgctaaggtagcataatcaattggctttta120attaaagtctggaatgaaagggaaaatgaaaaataactgtcttaaatatattatataaaa180tttatttatcaggtgcaaatacctgtattttgaataaagacgagaagaccctatgagttt240taattaatattaatcactgaattatttatttttttgttggggcgacatgttaacattttg300aacttaacttataatatttagcgtaattgtaaaatgaatttaaactaccttagggataac360agcataatttatttttaagtttgtgacctcgatgttggactaggaactatatggctaacc420gttaaattagatttgttctgttcgaacaatattatcctacgtgatctgagttcagaccgg48011456DNA凸旋螺Gyraulusconvexiusculus11cgcctgtttatcaaaaacatagttttatgattatatataaaatattttctgcccagtgtc60agtagataaatggccgcagtaccttgactgtgctaaggtagcataatcaattggctttta120attgaagtctagaatgaatgggataatggaatttagctgtcttgatttttttaataaaaa180tttatttataaggtgaaaataccttaaattataataaagacgagaagaccctatgaattt240ttaaattttttgttggggcgacagtttaaaaataaatcttaaatttaaaatatataacga300tttttttaataaaaattaaattaccttagggataacagcattattatttaaatagtttgt360gacctcgatgttggactaggaactaaaaggctaaccgtctttatagatttgttctgttcg420aacaattttatcctacatgatctgagttcagaccgg45612458DNA小旋螺Gyraulusparvus12cgcctgtttatcaaaaacatagttttatgattatatataaaatattttctgcccagtgtc60agtagataaatggccgcagtaccttgactgtgctaaggtagcataatcaattggctttta120attggagtctagaatgaatgggataatggaatttagctgtcttgatttttctaataaaaa180tttatttataaggtgaaaataccttaaattataataaagacgagaagaccctatgaattt240ttaaatttttttgttggggcgacagtttaaaataaaaatcttaaatttaaaatatataac300gatttttttaataaaaattaaattaccttagggataacagcattattattcaaatagttt360gtgacctcgatgttggactaggaactaaaaggctaaccgtctttatagatttgttctgtt420cgaacaattttatcctacatgatctgagttcagaccgg458

权利要求：1.一种藁杆双脐螺的分子鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.提取待测样品总DNA；S2.以步骤S1总DNA为模板，分别扩增其COI基因和16SrDNA基因；S3.对步骤S2的扩增产物进行测序，与藁杆双脐螺和扁蜷螺的COI基因和16SrDNA基因进行序列比对并构建进化树，计算物种间遗传距离；根据进化树聚类关系以及遗传距离鉴定藁杆双脐螺。2.根据权利要求1所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述扁蜷螺为大脐圆扁螺、凸旋螺或小旋螺中的一种或多种。3.根据权利要求1或2所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述COI基因的PCR扩增引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～2所示。4.根据权利要求1或2所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述16SrDNA基因的PCR扩增引物对包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：3～4所示。5.根据权利要求1或2所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述藁杆双脐螺的COI基因的核苷酸序列如KF926188所示或与所示序列具有至少99%序列同源性的序列。6.根据权利要求1或2所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述藁杆双脐螺的16SrDNA基因的核苷酸序列如KY697223或AY030213所示，或与所示序列具有至少99%序列同源性的序列。7.根据权利要求3所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述COI基因的PCR扩增反应体系为50μL反应体系：50ngDNA，20μM引物，45μLPCRMix；PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，45℃退火30s，72℃延伸15s，共28个循环；72℃延伸3min。8.根据权利要求4所述的分子鉴定方法，其特征在于，所述16SrDNA基因的PCR扩增反应体系为50μL反应体系：50ngDNA，20μM引物，45μLPCRMix；PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸15s，共35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。9.权利要求1～8任一项所述方法在制备藁杆双脐螺检测、鉴定试剂盒中的应用。10.一种藁杆双脐螺检测、鉴定试剂盒，其特征在于，包含SEQIDNO：1～2和SEQIDNO：3～4所示PCR扩增引物。

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