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申请/专利权人：绿色生物制品有限公司

申请日：2015-04-16

公开（公告）日：2017-02-22

公开（公告）号：CN106460000A

专利技术分类：...专门适用于大肠杆菌以外之原核细胞宿主（如乳杆菌、小单孢菌）的载体或表达系统〔5〕

专利摘要：本发明涉及一种用于在细菌基因组中产生和选择靶向突变的方法。尤其是，上述方法涉及用重组元件转化细菌，其包括所期望的突变，接着将重组元件同源重组进入细菌基因组；然后CRISPRCas系统用来消除不具有所期望突变的细菌。

专利权项：一种用于在细菌基因组内的预期诱变区IMR产生突变的方法，其中所述细菌包含CRISPRCas系统，以及其中所述IMR包含能够由所述细菌的CRISPRCas系统识别的CRISPR PAM原间隔区，所述方法包括以下步骤：a用重组载体来转化所述细菌的群体，其中所述重组载体包含重组元件，其中所述重组元件包含：i替换元件，其中所述替换元件包含突变，以及ii同源臂，所述同源臂侧接所述替换元件，其中所述同源臂能够促进由包含所述替换元件的元件来替代在所述细菌基因组中的全部或部分所述IMR，其中所述重组元件不包含CRISPR PAM原间隔区，所述CRISPR PAM原间隔区能够由crRNA识别，其中所述crRNA识别在所述IMR中的CRISPRPAM原间隔区；b在以下条件下培养所述细菌的群体，其中，在所述群体内的一种或多种细菌中，那些细菌的基因组中的全部或部分所述IMR由包含所述替换元件的元件替代，并由此从那些细菌的所述基因组中的所述IMR除去所述CRISPR PAM原间隔区，或使所述CRISPR PAM原间隔区不能由识别所述IMR中的所述CRISPRPAM原间隔区的crRNA所识别；c用能够引导产生crRNA的杀伤载体来转化所述细菌的群体，所述crRNA靶向所述群体中的任何细菌的所述IMR中的所述CRISPR PAM原间隔区，其中还未除去所述CRISPR PAM原间隔区或使所述CRISPR PAM原间隔区不能由所述crRNA识别，从而促进基因组DNA中由所述crRNA识别的那些CRISPRPAM原间隔区的CAS内切核酸酶诱导的切割以及那些细菌的随后死亡；以及d从所述群体选择或分离一种或多种细菌，其基因组包含包括所述突变的替换元件。

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