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申请/专利权人：辽宁大学

摘要：本发明涉及一种抗生素产生菌Lnu‑13的发酵条件。本发明针对抗生素产生菌Lnu‑13的发酵条件进行了研究，比较在不同的营养条件和培养条件下，菌株Lnu‑13抗生素的产生情况。确定最佳发酵培养基配方为：玉米粉 3.0％、花生饼粉 2.0％、MgSO40.03％、NaCl0.01％，CaCO3 0.2％。最佳发酵条件为：发酵培养基的初始pH7.0，培养温度28℃，摇床速度180rmin，培养时间为5天。本发明的Lnu‑13菌株，对多种植物病原菌和金黄葡萄球菌Staphylococcus aureus等革兰氏阳性细菌有较强的抗性，具有很好的开发应用前景。

主权项：抗生素产生菌Lnu‑13的发酵培养基，其特征在于：所述的发酵培养基，按重量百分比组成为：玉米粉3.0％，花生饼粉1.5％，CaCO3 0.2％，NaCl 0.02％，MgSO4 0.01％，余量为水，pH7.2～7.4；或，玉米粉3.0％、花生饼粉2.0％、MgSO40.03％、NaCl 0.01％，CaCO3 0.2％，余量为水，pH7.0；或，玉米粉3.0％，花生饼粉1.5％，CaCO3 0.2％，NaCl 0.02％，MgSO4 0.01％，余量为水，pH 7.0；所述的发酵培养基用于发酵抗生素产生菌Lnu‑13；所述的抗生素产生菌Lnu‑13为链霉菌Lnu‑13Streptomyces sp.lnu‑13，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014555。

全文数据：抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件技术领域[0001]本发明属于微生物发酵技术领域。具体地涉及抗生素产生菌Lnu-13的最佳发酵培养基及发酵条件。[0002]本发明所称的抗生素产生菌Lnu-13，命名为链霉菌Lnu-13Streptomycessp.lnu-13，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏单位地址，中国，武汉大学，保藏编号为CCTCCN0:M2014555。背景技术[0003]放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，广泛应用的抗生素约70%是各种放线菌所产生。一些种类的放线菌还能产生各种酶制剂、维生素和有机酸等。此外，放线菌还可用于留体转化、烃类发酵、石油脱蜡和污水处理等方面。因此，开发新的抗生素生产菌种在医药工业及农业生物防治上有重要意义。发明内容[0004]抗生素是微生物的次级代谢产物，其生产水平不仅取决于菌种本身的性能，而且还受营养条件、PH值大小、温度高低、甚至发酵时间等多种因素的影响和调控，这些因素相互作用又相互制约。[0005]本发明的目的是提供一种新的抗生素生产菌种，本发明所述的抗生素产生菌，命名为链霉菌Lnu-13Streptomycessp.lnu-13，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCN0:M2014555。[0006]本发明的另一目的是提供优化的抗生素产生菌Lnu-13的发酵条件，为Lnu-13的工业化生产和应用提供理论基础。[0007]本发明的链霉菌Lnu-13Streptomycessp.lnu-13，是从辽宁省仙人洞国家自然保护区土壤中分离得到。将土壤样品用无菌水稀释IO5浓度，利用高氏一号培养基，采用常规的平板划线分离法进行分离培养，挑取放线菌单菌落，编号备用，筛选而得。[0008]1、链霉菌Lnu-13的显微形态特征[0009]图1为Lnu-13在光学显微镜100X下的孢子丝和气生菌丝形态，形态特征:基内菌丝无横膜，不断裂;气生菌丝多分枝，孢子丝大部分为直、波曲状、钩形、小螺旋和松散的螺旋状一般1〜2圈），孢子呈圆形、椭圆形和梭形;图2为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征[0010]正面），图中显示Lnu-13在高氏一号培养基上生长良好，表面形状为棉絮状；图3为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征反面），图中显示菌落与培养基着生紧密，有黄色色素生成，均符合链霉菌属的特征。[0011]2、Lnu-13生理生化特性：[0012]纤维素水解实验、明胶液化实验、硫化氢实验、牛奶凝固与胨化实验均呈阳性;淀粉水解实验、MR实验、VP实验、色氨酸分解实验、柠檬酸盐实验、卵磷脂酶、硝酸盐还原实验均呈阴性;可利用葡萄糖、果糖、木糖、乳糖、淀粉、蔗糖、半乳糖、纤维二糖作为碳源生长，在含有葡萄糖、半乳糖和蔗糖的培养基上生长旺盛，对淀粉和纤维二糖的利用能力较差。[0013]3、链霉菌Lnu-13的16SrDNA序列分析方法：[0014]1链霉菌Lnu-13的DNA提取采用反复冻融法，以此为模板进行PCR扩增。[0015]2PCR引物：正向引物BSF827:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'[0016]反向引物BSRl5411522:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'[0017]3PCR引物由上海生物工程有限公司合成。[0019]5PCR扩增条件：94°C5min;94°C30s，57cC30s，72cC1·5min;30个循环；72cC5min。[0020]本发明链霉菌Lnu-13菌株，PCR产物测序由上海生物工程有限公司完成，测得的序列如SCQIDNO.1所示，将所测得的16SrDNA序列用BLAST搜索工具从GeneBank中调出与其相关的16SrDNA序列，然后用CLASTALX软件进行多序列比对，并采用MEGA4.1软件中的邻位相接法Neighbor-Joining进行系统进化树的构建与同源性比较，所构建的系统进化树见图4。结果与已报道的蓝色链霉菌（Streptomycescyaneus同源性达到99%，结合生理生化反应特性，鉴定抗生素产生菌Lnu-13为蓝色链霉菌属。[0021]抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，发酵培养基的碳源为玉米粉，氮源为花生饼粉。优选的，发酵培养基的组成如下：按重量百分比，玉米粉3.0%，花生饼粉2.0%，MgS〇4〇.03%，NaCl0.01%，CaCO30.2%，余量为水。发酵的最佳培养时间是5天，发酵培养基的初始pH为7.0，装液量是60ml250ml三角瓶，培养温度是30°C，摇床速度180rmin。[0022]本发明的有益效果是:本发明通过确定了生物防治菌Lnu-13的最佳发酵条件，为Lnu-13的工业化生产和应用提供理论基础，采用本发明所述的发酵条件，Lnu-13发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显高于原始发酵培养基，抑菌圈直径达到2.66cm，通过发酵培养基的优化将Lnu-13抗生素的产生能力提高了16.5%。附图说明[0023]本发明所称的抗生素产生菌，命名为链霉菌Lnu-13Streptomycessp.lnu-13，已于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCΝ0:Μ2014555。[0024]图1为Lnu-13的孢子丝和气生菌丝形态光学显微镜100X。[0025]图2为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征正面）。[0026]图3为Lnu-13在高氏一号培养基上培养特征反面）。[0027]图4为Lnu-13菌株的系统发育进化树。[0028]图5为不同碳源对抗生素生成的影响。[0029]图6为不同氮源对抗生素生成的影响。[0030]图7为不同pH对抗生素生成的影响。具体实施方式[0031]菌株：链霉菌Lnu-13Streptomycessp.lnu-13，于2014年11月6日，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCN0:M2014555。[0032]供试菌:金黄葡萄球菌Staphylococcusaureus，购自武汉大学菌种保藏中心[0033]实施例1碳源对链霉菌Lnu-13Streptomycessp·lnu-13发酵培养基的影响[0034]1将链霉菌Lnu-13于种子培养基中培养；种子培养基：可溶性淀粉20g，KN03lg，NaClO·5g，KH2PO4O·5g，MgS〇4〇·Ig，FeS〇4〇·0Ig，琼脂20g，水1000ml，pH7·2〜7·4。[0035]2发酵培养基：碳源3·0%，KNO31·5%，CaCO3O·2%，NaCl0·02%，MgS〇4〇·01%，余量为水，PH7.2〜7.4，121°C湿热灭菌20min。[0036]3发酵:分别用玉米粉、淀粉、甘油、葡萄糖、蔗糖作为发酵培养基的碳源，以不加任何碳源作为空白对照，每一种配制三份培养液作为重复。121°C湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的链霉菌Lnu-13的菌悬液IOOul，180rmin30°C恒温摇床培养5d，8000rmin离心lOmin，取上清液，得不同的发酵液。[0037]4杯碟法进行拮抗实验[0038]将4ml无菌水加入到金黄色葡萄球菌斜面中，用接种环刮下病原菌，制成菌悬液，备用。配制牛肉膏蛋白胨养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15-25g，水1000ml，pH7.4-7.6。灭菌，当培养基冷却到不烫手时，加入金黄色葡萄球菌悬液，轻轻摇匀，倒平板，待平板冷却，牛津杯摆在平板上，将制得的不同的发酵液用移液枪加到牛津杯中，每个200ul，37°C培养20h，测量抑菌圈直径，结果如图5。图5中抑菌圈直径的测量结果见表1[0039]表1不同碳源对抗生素生成的影响[0041]抗生素产生菌Lnu-13能利用多种碳源有效的合成抗生素，玉米粉发酵液形成的抑菌圈直径为2.40cm，效果最佳。与其它碳源存在显著性差异，而且玉米粉价格比较低廉，所以无论是从发酵效果还是经济性方面考虑，玉米粉都是最优碳源，适于工业上大规模生产。[0042]实施例2氮源对链霉菌Lnu-13Streptomycessp·lnu-13发酵培养基的影响[0043]1将链霉菌Lnu-13于种子培养基中培养:同实施例1。[0044]2发酵培养基：玉米粉3·0%，氮源I·5%，CaCO3O·2%，NaCl0·02%，MgS〇4〇·01%，余量为水，PH7.2〜7.4，121°C湿热灭菌20min。[0045]3发酵：分别用蛋白胨、花生饼粉、酵母膏、豆饼粉、KNO3作为发酵培养基的氮源，以不加任何氮源作为空白对照，每一种配制三份培养液作为重复。121°C湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的链霉菌Lnu-13的菌悬液200ul，180rmin30°C恒温摇床培养5d，8000rmin离心lOmin，取上清液，得不同的发酵液。[0046]4杯碟法进行拮抗实验[0047]方法同实施例1，测量抑菌圈直径，结果如图6。图6中抑菌圈直径的测量结果见表2[0048]表2不同氮源对抗生素生成的影响[0050]由表2可见，以蛋白胨、酵母膏、花生饼粉、豆饼粉、KNO3作为氮源时，抗生素产生菌Lnu-13都可以利用其产生拮抗物质。其中以花生饼粉为氮源的发酵液形成的抑菌圈直径为2.61cm，效果较好。[0051]实施例3初始pH对链霉菌Lnu-13Streptomycessp·lnu-13发酵培养基的影响[0052]1将链霉菌Lnu-13于种子培养基中培养:同实施例1。[0053]2发酵培养基：玉米粉3.0%，花生饼粉1.5%,CaCO3O.2%，NaCl0.02%，MgS〇4〇.〇l%，余量为水，初始pH5.0-9.0灭菌前），121°C湿热灭菌20min。[0054]3发酵:初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，每一种配制三份培养液作为重复。121°C湿热灭菌20min。分别往不同的发酵培养基中接入活化的抗生素产生菌Lnu-13的菌悬液200ul，180rmin30°C恒温摇床培养5d，8000rmin离心IOmin，取上清液，得不同的发酵液。[0055]4杯碟法进行拮抗实验[0056]方法同实施例1，测量抑菌圈直径，结果如图7。图7中抑菌圈直径的测量结果见表3〇[0057]表3不同初始pH对抗生素生成的影响[0059]由表3可见，当pH为7.0时，抑菌圈直径为2.54cm，发酵液的抑菌效果最好，结果表明菌株Lnu-13在接近中性产生的抗生素最多，过酸或过碱都会对抗生素的产量有负面影响。[0060]实施例4四因素对链霉菌Lnu-13Streptomycessp·lnu-13产素能力的影响[0061]采用L934正交表进行设计试验，对抗生素产生菌Lnu-13发酵培养基进行了优化研究。选取影响Lnu-13生长的4个营养因子，即碳源（玉米粉）、氮源（花生饼粉）、MgS04、NaCl，正交实验因素和水平见表4，每一处理重复3次，250ml摇瓶中装液量为60ml，接种量为200μ1初始pH为7.0，摇床转速为180rmin，30°C恒温摇床培养5d后测量发酵液的抑菌效果，正交试验对培养基各组分优化的结果见表5。从结果可以看出，在供试的浓度变化范围内，各因素对Lnu-13产生抗生素的影响程度为，即碳源〉氮源〉NaClMgS04,表明碳源和氮源是影响Lnu-13菌株摇瓶发酵产生抗生素的主要因素，从正交实验结果可以看出最佳的配比为A2B2C3D2，在正交试验设计中抑菌效果最佳配比为A2B2C3D1，但从K值来看，D因素影响较小，结合成本考虑，最佳配比为A2B2C3D1，培养基配方为：玉米粉3.0%、花生饼粉2.0%、MgSO4O·03%、NaCl0·01%，CaCO3O·2%，余量为水。[0062]表4正交实验因素和水平[0064]表5正交试验对培养基各组分优化的结果分析[0066]实施例5优化培养基配方与原始发酵培养基配方抑菌效果的比较[0067]菌株Lnu-13在高氏一号斜面培养基上30°C培养，产生足量的孢子后制成孢子悬浮液，以200ul的量接种分别接种于250ml三角瓶内的60ml的原始发酵培养基（淀粉3.0%，KNO31.5%，CaCO30.2%，NaCl0.02%，MgSO40.01%，余量为水，）及优化后发酵培养基（玉米粉3·0%、花生饼粉2·0%、MgS〇4〇·03%、NaCl0·01%，CaCO3O·2%，余量为水）中，初始pH均为7.0,30€，1801'111；[11振荡培养5天。发酵液700017111；[11离心20111；[11，取上清液采用杯碟法测量发酵液的抑菌效果。方法同实例1。结果如下，原始发酵液抑菌圈直径为2.22cm.而优化后的发酵培养基的抑菌圈直径为2.66cm，通过发酵培养基的优化将Lnu-13抗生素的产生能力提尚了16.5%。

权利要求：1.抗生素产生菌Lnu-13的发酵培养基，其特征在于:所述的发酵培养基，按重量百分比组成为：玉米粉3.0%，花生饼粉1.5%030.2%，他：10.02%，]\%3〇4〇.01%，余量为水，卩!17.2〜7.4;或，玉米粉3.0%、花生饼粉2.0%、]\^5040.03%、似：10.01%，〇：030.2%，余量为水，ρΗ7·0;或，玉米粉3.0%，花生饼粉1.5%，CaC030.2%，NaCl0.02%，MgS〇40.01%，余量为水，pH7.0;所述的发酵培养基用于发酵抗生素产生菌Lnu-13;所述的抗生素产生菌Lnu-13为链霉菌Lnu-13Streptomycessp.lnu-13，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCN0:M2014555。2.抗生素产生菌Lnu-13的发酵方法，其特征在于:将抗生素产生菌Lnu-13用种子培养基活化，活化后的菌株制备成菌悬液，置于权利要求1所述的发酵培养基中，调节初始pH7.0，培养温度30°C，装液量60ml250ml，三角瓶摇床速度180rpmmin，发酵5天;所述的抗生素产生菌Lnu-13为链霉菌Lnu-13Streptomycessp.lnu-13，在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCN0:M2014555。3.如权利要求2所述的抗生素产生菌Lnu-13的发酵方法，其特征在于:所述的种子培养基配方:可溶性淀粉20g，KN03lg，NaCl0.5g，K2HP〇40.5g，蒸馏水1000ml，pH7.3。

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