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申请/专利权人：福建师范大学

摘要：本发明提供了GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用、直肠癌预后评估试剂盒及方法。本发明采用免疫组化方法检测GIPC2蛋白在直肠癌组织中的相对表达量，以此判断直肠癌患者出现直肠癌复发转移的风险。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示GIPC2蛋白能用于制备判断直肠癌患者预后的蛋白质分子标记，对于直肠癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

主权项：GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用。

全文数据：GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用、直肠癌预后评估试剂盒及方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用、直肠癌预后评估试剂盒及方法。背景技术[0002]直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，占胃肠道肿瘤的第二位，好发部位为直肠及直肠与乙状结肠交界处，占60%，发病多在40岁以后，男女患病比例为2:1。[0003]直肠癌在早期缺少症状，病人无明显异常改变。当肿块达1〜2cm时，由于肿瘤的侵蚀，肠粘膜遭受到肿块的异物性刺激，分泌物增多，因此在排便时也有少量的粘液排出，多数在大便的前端或于粪便的外面附着。随着肿瘤的增大，分泌粘液也增加，有时随着排气或突然咳嗽腹内压增加，可有粘液从肛门流出。当肿瘤增大，形成溃疡或有坏死合并感染时，便会出现明显的直肠刺激症状，出现排便次数和粪便性质的改变。排便次数增加，每天2〜3次，呈粘液便，稀便，粘液血便。常被误诊为“肠炎”“痢疾”“溃疡性结肠炎”等。但是，直肠癌腹泻症状并不象结肠炎那样，来势急，好转快;也不象痢疾那样典型的出现里急后重症状。直肠癌的直肠刺激症状是既缓慢又逐渐进展，在合并感染时刺激症状明显，一经对症处理也可以暂时好转，但是经过较长时间的治疗仍有粘液血便者，应引起足够的重视。[0004]直肠癌的病因尚未完全清楚。直肠癌的早期发现、早期诊断，是提高疗效的关键。直肠癌的发生发展及预后与癌基因的激活和抑癌基因功能失活密切关联，是多因素诱导，多基因参与的复杂病理过程。近年来，直肠癌早期复发转移的分子机制是该领域的热门课题，深入阐明该分子机制，并在其特异性环节中导入靶向性治疗措施，有望很大幅度提高直肠癌术后总体治疗效果。因此，探寻切实有效的直肠癌直肠切除术后早期复发相关预警分子标志，阐明其与直肠癌早期复发转移的关系，这对提高直肠癌术后治疗效果、评估直肠癌早期复发风险、判断预后和个体化治疗有着至关重要的意义。[0005]GIPC2GIPCPDZdomaincontainingfamilymember2是一种包含F1DZ结构域的接头蛋白。目前发现GIPC2在胃癌中上调，但是在白血病和肾癌中则是下调，显示其可能与肿瘤的发生相关。[0006]直肠癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而GIPC2做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道GIPC2蛋白与判断直肠癌预后或直肠癌转移相关。而本发明研究发现在直肠癌中的GIPC2表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示GIPC2可作为直肠癌的术后预后的有效预警蛋白。发明内容[0007]本发明目的在于提供GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用，并提供用于直肠癌术后预后评估的试剂盒及方法。[0008]本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测GIPC2蛋白在直肠癌组织中的相对表达量，能够判断直肠癌患者出现直肠癌复发转移的风险。基于GIPC2蛋白表达量与直肠癌复发转移的相关性，以GIPC2蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导直肠癌的预后判断。[0009]因此，本发明提供了GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是以GIPC2蛋白作为分子标记，利用GIPC2单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测GIPC2蛋白在直肠癌组织中的相对表达量。[0010]本发明还提供了所述应用中用于直肠癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：人源GIPC2单克隆抗体或GIPC2多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。[0011]发明人研究发现，GIPC2在复发转移直肠癌组织中表达低于未复发转移直肠癌组织，可以推测GIPC2在直肠癌术后复发转移发挥重要作用。查阅国内外文献，GIPC2与直肠癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本研究中，GIPC2在直肠癌组织中的表达下调，而在癌旁和正常直肠组织中则表达上调，且与未复发转移组相比，GIPC2在复发转移组中表达也下调，表明GIPC2可能作为抑制因子参与直肠癌发生发展过程。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，GIPC2表达程度与直肠癌患者的预后有关，GIPC2低表达的患者预后不良（P〈0.05。[0012]综上所述，GIPC2在直肠癌组织中低表达，GIPC2的低表达与直肠癌患者术后复发转移有关。GIPC2可以作为直肠癌预后的一个重要候选分子标记物。[0013]优选的，所述人源GIPC2多克隆抗体由序列为SEQIDN0.1所示的GIPC2蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。[00M]本发明所述免疫组化实验试剂包括:二甲苯、乙醇、3%H2〇2冰溶液）、3%BSA封闭液（以PBS配制）、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶（用于标记二抗）、PBSpH7.4、0.0IMEDTA修复液。[0015]利用本发明所述试剂盒进行直肠癌术后预后评估的方法如下：[0016]1取直肠癌患者病理标本，利用人源GIPC2单克隆抗体或人源GIPC2多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；[0017]其中，病理标本来自于直肠癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：[0018]a制备直肠癌组织石蜡切片，60°C烤箱过夜。[0019]b切片脱腊。依次浸泡:二甲苯I:IOmin;二甲苯II:IOmin;二甲苯III:lOmin。[0020]c切片水化。依次浸泡:无水乙醇：3min;90%vv乙醇：3min;80%乙醇：3min;75%乙醇：3min。[0021]dPBS清洗3次，每次5min。[0022]eEDTA抗原高压修复:切片放入0.OlMEDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。[0023]f加入300yL的3%ww过氧化氢水溶液，ST-ClOminc3PBS清洗3次，每次5min。[0024]g加入300yL的3%wwBSA封闭液PBS配制），37Γ1ΚΡΒ3清洗3次，每次5min。[0025]h加入一抗:GIPC2抗体浓度：1:500，4°C冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。[0026]i滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释）JT-CASminc3PBS洗4次，每次5min。[0027]jPBS洗3次，每次SmiruDABDAB显色试剂盒，购自上海生工）显色2-10min，镜下观察;双蒸水洗止显色，苏木素复染IOs，用自来水冲洗浸泡。[0028]k脱水。依次浸泡：75%乙醇：2min;80%乙醇：2min;90%乙醇：2min;无水乙醇：2min〇[0029]L用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。[0030]2利用显微镜和成像装置随机选取直肠癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用AperioImageScope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的AlgorithmsPositivePixelCountV9程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：[0031][0033]3每个组织样本的免疫组织化学评分计算为PositivityXLoglO[255Iavg]，其中Positivity=NPositiveNTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量显色总数量；Iavg=Iwp+Ip+IspNwp+Np+Nsp，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度=弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度八弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量），即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。[0034]4采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验（log-ranktest比较生存曲线的差别。本发明显示GIPC2蛋白与直肠癌的预后具有显著的相关性，为预测直肠癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对直肠癌患者的预后有重要作用。当癌组织GIPC2免疫组化评分低于0.365时，直肠癌易出现复发转移，直肠癌患者术后易死亡。[0035]本发明的有益效果主要体现在:本发明研究发现在直肠癌中的GIPC2表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示GIPC2可作为直肠癌的术后预后的有效预警蛋白。因此，本发明提供了GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断直肠癌患者预后的蛋白质分子标记，对于直肠癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。附图说明[0036]图1为GIPC2在直肠癌患者术后1年内无复发转移的组织样本中高表达；[0037]图2为GIPC2在直肠癌患者术后1年内复发转移的组织样本中弱表达；[0038]图3为GIPC2在直肠癌旁组织中高表达；[0039]图4为直肠癌组织中GIPC2低表达组与高表达组生存曲线；具体实施方式[0040]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：[0041]实施例1[0042]用于直肠癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：用于对直肠癌组织中的GIPC2蛋白的相对表达量进行检测的人源GIPC2单克隆抗体或GIPC2多克隆抗体、免疫组化实验试剂。其中，免疫组化实验试剂包括:二甲苯、乙醇、3%H2O2、3%BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、PBS以及0.0IMEDTA修复液。[0043]本发明所述人源GIPC2多克隆抗体由序列为SEQIDN0.1所示的GIPC2蛋白免疫兔子获得。可自行制备，也可采用市购商品。[0044]本发明所述免疫组化实验试剂包括:二甲苯、乙醇、3%H202水溶液）、3%BSA封闭液（以PBS配制）、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶（用于标记二抗）、PBSpH7.4、0.0IMEDTA修复液。[0045]实施例2[0046]GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是利用本发明试剂盒进行直肠癌术后预后评估，方法如下：[0047]1取直肠癌患者病理标本，利用人源GIPC2单克隆抗体或人源GIPC2多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；[0048]其中，病理标本来自于直肠癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：[0049]a制备直肠癌组织石蜡切片，60°C烤箱过夜。[0050]b切片脱腊。依次浸泡:二甲苯I:IOmin;二甲苯II:IOmin;二甲苯III:lOmin。[0051]c切片水化。依次浸泡:无水乙醇：3min;90%vv乙醇：3min;80%乙醇：3min;75%乙醇：3min。[0052]dPBS清洗3次，每次5min。[0053]eEDTA抗原高压修复:切片放入0.OlMEDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。[0054]f加入300yL的3%ww过氧化氢水溶液，ST-ClOminc3PBS清洗3次，每次5min。[0055]g加入300yL的3%wwBSA封闭液PBS配制），37Γ1ΚΡΒ3清洗3次，每次5min。[0056]h加入一抗:GIPC2抗体浓度：1:500，4°C冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。[0057]i滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释）JT-CASminc3PBS洗4次，每次5min。[0058]jPBS洗3次，每次SmiruDABDAB显色试剂盒，购自上海生工）显色2-10min，镜下观察;双蒸水洗止显色，苏木素复染IOs，用自来水冲洗浸泡。[0059]k脱水。依次浸泡：75%乙醇：2min;80%乙醇：2min;90%乙醇：2min;无水乙醇：2min〇[0060]L用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。[0061]2利用显微镜和成像装置随机选取直肠癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用AperioImageScope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的AlgorithmsPositivePixelCountV9程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：[0062][0063]3每个组织样本的免疫组织化学评分计算为PositivityXLoglO[255Iavg]，其中Positivity=NPositiveNTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量显色总数量；Iavg=Iwp+Ip+IspNwp+Np+Nsp，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度=弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度八弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量），即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。GIPC2高低表达标准以268例直肠癌组织中GIPC2表达评分的中位数0.365为界。[0064]4采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验（l〇g-ranktest比较生存曲线的差别。[0065]按照上述方法，本发明在268例直肠癌病人的肿瘤组织中检测结果如图1-3所示：GIPC2在1年内无复发转移组中高表达;在复发转移组中弱表达图2;在癌旁组织中高表达图3。[0066]GIPC2与直肠癌患者预后的关系：[0067]通过Kaplan-Meier生存曲线分析，GIPC2的表达程度与直肠癌患者的预后相关，如图4所示，GIPC2低表达的患者平均生存期存活率低于GIPC2高表达的患者。[0068]实施例3[0069]取某直肠癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的GIPC2免疫组化组织评分为0.236。经过术后随访发现，该患者在术后第9个月发生直肠癌复发转移，术后十七个月死亡。[0070]实施例4[0071]取某直肠癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的GIPC2免疫组化组织评分为0.432。经过术后随访发现，该患者在术后1年均未发现转移复发，健在。[0072]由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测GIPC2蛋白分子相对表达量能预测直肠癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织GIPC2的免疫组化评分低于0.365时，直肠癌易出现复发转移，直肠癌患者术后易死亡。显然GIPC2蛋白与直肠癌具有相关性，因此，以GIPC2蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测直肠癌手术后复发转移等事件，并判断预后。

权利要求：I.GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述的GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：以GIPC2蛋白作为分子标记，利用人源GIPC2单克隆抗体或人源GIPC2多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测GIPC2蛋白在直肠癌组织中的相对表达量。3.根据权利要求2所述的GIPC2蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于:所述人源GIPC2多克隆抗体由序列为SEQIDNO.1所示的GIPC2蛋白免疫兔子获得。4.应用于直肠癌术后预后评估的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于对直肠癌组织中的GIPC2蛋白的相对表达量进行检测的人源GIPC2单克隆抗体或人源GIPC2多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂。5.根据权利要求4所述的应用于直肠癌术后预后评估试剂盒，其特征在于:所述免疫组化实验试剂包括:二甲苯、乙醇、3%H2〇2、3%BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、PBS以及0.0IMEDTA修复液。6.—种基于权利要求4所述的试剂盒进行直肠癌术后预后评估的方法，其特征在于:其包括以下步骤：1取直肠癌患者病理标本，利用人源GIPC2单克隆抗体或人源GIPC2多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；2利用显微镜和成像装置随机选取直肠癌组织和癌旁组织3个视野拍摄为数码照片；3利用AperioImageScope软件对组织样本进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms程序对每个样本进行阳性强度计算，换算为该样品的免疫组织化学评分；4通过所得到的评分评估患者术后的预后情况。

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