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申请/专利权人：中国农业科学院蜜蜂研究所

摘要：本发明涉及食品安全领域，具体公开了东茛菪碱作为有毒蜂蜜的生物标志物及其在鉴别有毒蜂蜜中应用。本发明经研究发现，常规认知中曼陀罗的有毒物质阿托品在曼陀罗源蜂蜜中的含量并不高，反而是东茛菪碱在毒性和含量上均超过阿托品成为曼陀罗源有毒蜂蜜的关键致毒成分，因此东茛菪碱尤其适用于曼陀罗源有毒蜂蜜的识别和鉴定，以及蜜蜂中毒人群的确证性诊断。在此基础上，本发明进一步提出了蜂蜜样本中东茛菪碱的UHPLC‑Q Exactive plus检测分析方法，并对蜜蜂样本的前处理条件和检测参数进行了优化。本发明所提供的有毒蜂蜜的生物标志物和检测方法，对保护蜂蜜消费者的生命健康和维护蜜蜂消费行业的健康发展具有重要现实意义。

主权项：1.东茛菪碱作为生物标志物在鉴别有毒蜂蜜方面的应用，其特征在于，所述东茛菪碱的化学结构为：

全文数据：东茛菪碱作为有毒蜂蜜的生物标志物及其在鉴别有毒蜂蜜中应用技术领域[0001]本发明涉及食品安全领域，具体地涉及东茛菪碱作为有毒蜂蜜的生物标志物及其在鉴别有毒蜂蜜中应用。背景技术[0002]蜂蜜是蜜蜂从开花植物的花中采得的花蜜与自身分泌物混合后，经充分酿造存储在蜂巢中食物。蜂蜜属于传统的天然甜味食品，除了含有较多的糖类物质之外，还含有多种黄酮类、酚酸类、维生素、氨基酸及多种人类必须的微量元素，具有美容、养颜、安神等保健功能，深受广大消费者喜爱。然而，近年来我国多个地区陆续爆发了多起蜂蜜中毒事件，据不完全统计，2014-2017年，四年期间我国一共爆发了13起蜂蜜中毒事件，涉及的中毒人群高达95人，致人死亡的有15人，致死率高达15.8%，蜂蜜中毒事件对我国危害严重，已经属于严重的公共卫生事件，受到全社会的关注。[0003]曼陀罗属于茄科的一年生草本有毒开花植物，广泛分布于世界温带至热带地区，在我国各地均有分布。由于曼陀罗具有一定药用和观赏价值，催生了一些曼陀罗的大规模种植基地。曼陀罗作为已知的有毒蜜源植物，在其盛花期，当其它蜜源植物匮乏，曼陀罗成为优势蜜源植物时，蜜蜂便会采集曼陀罗的花蜜酿制有毒蜂蜜。人一旦误食，便会发生中毒反应。有关曼陀罗蜂蜜中毒事件在国内外均有相关报道，但是对于相关识别和鉴定方法缺乏系统的研究。[0004]目前，曼陀罗源有毒蜂蜜致人中毒的物质基础尚不清楚。根据现有技术对曼陀罗的报道，人们普遍认为，阿托品为曼陀罗有毒蜂蜜发挥毒性的重要成分刘炳仑.我国14种有毒蜜源植物及其花粉形态二）.蜜蜂杂志，199503:23〜25。然而本发明发明人经过对曼陀罗源有毒蜂蜜的大量研究发现，有毒蜂蜜中的阿托品含量仅为0.21-1.34mgkg，并不足以成为蜂蜜致毒的关键。因此，急需开展相关的科学研究，阐明曼陀罗源有毒蜂蜜的物质基础，找出其生物标志物，并建立有毒蜂蜜的鉴别和检测方法。这对于保障蜂蜜消费者的生命健康和维护蜂产业的健康发展具有重大的现实意义。发明内容[0005]本发明针对当前采用花粉形态鉴别法识别和鉴定曼陀罗有毒蜂蜜的缺陷和不足，基于液相串联质谱技术，识别和鉴定出了一种曼陀罗有毒蜂蜜的生物标志物（东茛菪碱），并采用UHPLC-HRMS建立了蜂蜜中东茛菪碱的检测方法，用于曼陀罗有毒蜂蜜的识别与鉴定以及蜂蜜中毒人群的快速诊断。[0006]为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。[0007]本发明的技术方案之一是:建立了液相串联高分辨质谱技术进行识别和鉴定蜂蜜样本中阿托品类生物碱的方法。该方法采用UHPLC-QExactivePlus超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱进行检测曼陀罗的花蜜及有毒蜂蜜，通过查看图谱，采集的数据由软件CD2.0进分析处理，共识别和鉴定出了四种阿托品类生物碱，其中包含茛菪碱、山茛菪碱、东茛菪碱及N-去甲基山茛菪碱，其中东茛菪碱的含量最尚，占到总生物碱的90%以上。鉴于东茛菪碱的高毒性LD50〈1.OmgkgB.W.小鼠口服及其在曼陀罗有毒蜂蜜中的高含量，将其作为曼陀罗有毒蜂蜜的生物标志物。东茛菪碱的化学结构如图1所示。[0008]本发明的技术方案之二是:基于液质联用技术建立了一种蜂蜜中东茛菪碱的高灵敏度的检测方法。该方法采用UHPLC-QExactivePlus超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱仪器检测蜂蜜样本。通过查看其图谱中是否含有东茛菪碱的特征峰，判定蜂蜜是否含有东茛菪碱，主要基于东茛菪碱在液质上的保留时间RT=4.28min、精确mz值为304.15439[IWmc17H22O4N+以及其特征性碎片离子的精确mz值为mz138.09134C8Hi2ON+，mz156.10196C8Hi402N+，mz121.06499C8H90+mz228.13850Ci5Hi8ON+。[0009]具体的，所述的采用UHPLC-QExactivePlus检测蜂蜜样本的图谱中应该含有东茛菪碱的精确mz值:304.15439[M+H]+;CnH22O4N+，其允许偏差应在5ppm以内。图2A展示了东茛菪碱在全扫描时的精确质量数质谱图。[0010]此外，为了提高有毒蜂蜜的鉴别能力，所述的东茛菪碱的色谱峰的保留时间应该满足4.28min允许误差应小于0.5min。而且其MSMS图谱子离子图谱）中应该含有东茛菪碱的特征碎片离子mz138.09134C8Hi2〇N+，mz156.10196C8Hi4〇2N+，mz121.06499C8H9O+mz228.13850C15H18ON+，且其精确质量数的误差应当小于5ppm。图2B展示了东茛菪碱精确质量数的子离子图谱。蜂蜜样本中只有在精确mz值、保留时间和特征碎片离子方面同时满足东茛菪碱的特征，方可肯定该蜂蜜样本含有东茛菪碱，并将其归为有毒蜂蜜样本。[0011]进一步地，在蜂蜜样本进行检测时，优选对其采用如下前处理方法:取蜂蜜样本Ig加入9mL20%甲醇水溶解，14000g4°C离心IOmin，过0.22μηι的滤膜，待上机分析。[0012]应当理解的是，对上述所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述内容的实质相同。[0013]进一步地，采用UHPLC-QExactiveplus对蜂蜜样本进行检测时，所述的液相条件如下：[0014]色谱柱:为C18色谱柱，柱温为室温:20°C。[0015]流动相组成:流动相A为0.1%的甲酸水，流动相B为0.1%的甲酸乙腈。[0016]梯度洗脱条件为：0-1·Omin，5%的B;1·0-2·Omin，5-20%的B;2·0-6·5min，20-50%的B;6·5-7·Omin，50-80%的B;7·0-7·Imin，80-100%的B;7·1-8·5min，100%的B;8·5-8.6min，100-5%的B;--p;;8.6-10min，95%的B。[0017]流速:0.30mLmin;进样量:5.0yL。[0018]所述的质谱条件如下：[0019]离子源参数：[0020]喷雾电压（sprayvoltage3.5kV;离子传输管温度（capillarytemperature320°C;S-lens电压（S-lensRFlevel60;离子源温度（Heatertemperature350°C;鞘气流速sheathgasflowrate45;辅助气流速（auxgasflowrate10;吹扫气流速（sweepgasflowrate0；[0021]采集的模式为正离子模式下的FyllMS-ddMS2:[0022]其中FyllMS的具体参数设置如下:分辨率Resolution:70000;自动增益控制目标离子数AGCTarget:3e6;允许最大离子注入时间MaximumIT:100ms;扫描范围（Scanrange:200_800Da;质谱图类型（Spectrumdata:Centroid〇[0023]其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率Resolution:15000;自动增益控制目标离子数AGCTarget:1.6e5;允许最大离子注入时间（MaximumIT:50ms;循环次数Loopcount:1;隔离窗口（Isolationwindow:2.ODa;归一化碰撞能量NCE:42;质谱图类型（Spectrumdata:Centroid。而ddsettings中，最小目标离子数（MinimumAGCTarget:8.0e3;顶点激发Apextrigger:2_6s;排除同位素峰Excludeisotope:on;动态排除Dynamicexclus:8.0s。[0024]本发明的公布的采用UHPLC-QExactiveplus仪器检测蜂蜜中的东茛菪碱，基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，其检出限可以达到1.0ygkg。基于本方法采用的仪器和公布的参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整。而且，即便是在缺乏东茛菪碱对照品的情况下，依然可以通过查看东茛菪碱的精确质量及其特征性的碎片离子来确定蜂蜜样本中是否含有东茛菪碱。东茛菪碱作为曼陀罗的特征性化合物，通过检测蜂蜜中是否含有东茛菪碱来鉴别蜂蜜是否含有东茛菪碱有毒蜂蜜。[0025]本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。[0026]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。附图说明[0027]图1为东茛菪碱的化学结构式。[0028]图2为东茛菪碱的精确质量数的质谱图㈧及其子离子图谱⑻。[0029]图3为东茛菪碱的精确提取质量色谱图（RT=4.25min:A东茛菪碱花蜜样本；⑻有毒蜂蜜样本；⑹正常蜂蜜样本。[0030]图4为曼陀罗鲜花中茛菪碱、山茛菪碱、东茛菪碱和N-去甲基山茛菪碱的精确提取粒子流色谱图。[0031]图5为曼陀罗花蜜中茛菪碱、山茛菪碱、东茛菪碱和N-去甲基山茛菪碱的精确提取粒子流色谱图。具体实施方式[0032]下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。[0033]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0034]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0035]实施例1[0036]试验案例：[0037]1、试验材料:黄色曼陀罗的鲜花、花蜜以及有毒蜂蜜；[0038]其中，曼陀罗的花蜜及有毒蜂蜜主要在云南祥云县曼陀罗种植基地获得。[0039]在曼陀罗的花期5月至7月，采摘曼陀罗的鲜花，并采用微量移液器吸取曼陀罗的花蜜。此外，为了获得曼陀罗的蜂蜜，在曼陀罗种植基地的花期之前的15天放置4箱蜜蜂，两箱意蜂，两箱中蜂，并且在放置之前，除去巢脾中的蜂蜜及花粉，蜂箱放置2周之后，让蜜蜂采集到足够的蜂蜜储存在巢脾中，然后每个蜂箱采集蜂蜜100_500g，巢脾中多于的蜂蜜销毁。[0040]2、从市场或者蜂农哪里购买常见的蜂蜜样本共20份，如油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、枣花蜂蜜、荆条蜂蜜、椴树蜂蜜、荔枝蜂蜜、龙眼蜂蜜以及枸杞蜂蜜。[0041]3、在2016年和2017年5月-7月份的曼陀罗的花期，从已经报道过的蜂蜜中毒高发区域采集蜂蜜12份，如云南大理上关镇、郑州乡河湾农场、梅州平远曼陀罗山庄、陕西甘肃等省市。[0042]上述采集的疑似有毒蜂蜜样本采用如下前处理方法进行处理，然后采用UHPLC-QExativePlus仪器进样分析。[0043]前处理方法具体为：取蜂蜜样本Ig加入9mL20%甲醇水溶解，14000g4°C离心lOmin，过0.22μπι的滤膜，待上机分析。至于采集曼陀罗鲜花，经剪碎，组织匀浆之后，再按照上述蜂蜜样本前处理方法进行处理，然后采用UHPLC-QExativePlus仪器进样分析。[0044]曼陀罗花蜜的收集量较少，未进行提取净化等措施，仅仅是将IOOyL的曼陀罗花蜜用900yL的20%甲醇水稀释，过0.22μπι的滤膜，待上机分析。[0045]采用UHPLC-QExactiveplus进行检测时，液相条件和质谱条件如本发明前述技术方案所述。[0046]通过对比东茛菪碱在色谱上的保留时间（RT=4.28min、精确质量数mz:304.15439见图2A以及精确MSMS图谱见图2B中主要碎片离子，确定曼陀罗的花蜜和有毒蜂蜜中含有大量的东茛菪碱。图3详细的展示了曼陀罗花蜜和蜂蜜中含有东茛菪碱，而正常蜂蜜样本中则不含有相应的色谱峰。因此，可以推断有毒蜜源植物曼陀罗中的毒性物质东茛菪碱通过蜜蜂的采蜜行为将其迀移并富集在蜂蜜中，形成有毒蜂蜜。[0047]在云南曼陀罗种植基地中采集的鲜花、花蜜和蜂蜜中除了检测到东茛菪碱之外，还检测到了茛菪碱、山茛菪碱、N-去甲基山茛菪碱见图4和图5。但是准确定量的结果表明有毒蜂蜜样本中东茛菪碱的含量远远大于茛菪碱、山茛菪碱及N-去甲基山茛菪碱。鉴于有毒蜂蜜样本中东茛菪碱与茛菪碱、山茛菪碱及N-去甲基山茛菪碱相比，不论是在含量和毒性上均具有一定的优势。基于此，将东茛菪碱作为曼陀罗有毒蜂蜜的生物标志物更为科学合理。[0048]为验证结论的可靠性，本发明在全国范围内采集20余份不同品种的蜂蜜样本作为空白对照，结果在采集的所有蜂蜜样本中均未检测到东茛菪碱。而且，本发明在2016年和2017年的曼陀罗，6-10月份采集了12份疑似蜂蜜样本，通过检测分析，其中7份样本中检测到了毒性物质东茛菪碱，其含量介于19.3-1321.8ygkg。[0049]应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。[0050]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.东茛菪碱作为生物标志物在鉴别有毒蜂蜜方面的应用，其特征在于，所述东茛菪碱的化学结构为：2.—种检测有毒蜂蜜方法，其特征在于，检测蜂蜜样本中是否含有东茛菪碱，当含有东茛菪碱时，判定为有毒蜂蜜。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用UHPLC-QExactivePuLs检测蜂蜜样本，通过查看其图谱中是否含有东茛菪碱的特征峰，判定蜂蜜是否含有东茛菪碱。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，东茛菪碱在UHPLC-QExactiveplus的精确提取粒子流色谱图中含有mz304.15439[M+H]+，C17H22O4N+准分子离子峰，东茛菪碱的子离子图谱MSMS中应含有碎片离子mz138.09134C8Hi2ON+，mz156.10196C8Hi4〇2N+，mz121.06499C8H9O+，且其精确质量数的误差应当小于5ppm。5.根据权利要求2〜4任一项所述的方法，其特征在于，蜂蜜样本在检测前，进行前处理:取蜂蜜样本用20%甲醇水稀释10倍，过0.22μπι的滤膜，待进样分析。6.根据权利要求3〜5任一项所述的方法，其特征在于，采用UHPLC-QExactivePlus检测时的液相条件如下：流动相为:A:0.1%甲酸水，B:0.1%甲酸乙腈；流速:0.30mLmin;色谱柱温度为:30°C;进样量为:5yL;色谱柱类型为C18;采用梯度洗脱程序；UHPLC-QExactiveplus的质谱条件如下：尚子化模式:正尚子模式；采集模式为FyllMassandddMS2;雾化气温度:320°C。

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