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申请/专利权人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

摘要：本发明公开了一种表达Pdx1insulin双报告基因的诱导多能干细胞系的构建及其应用。本发明提供了使多能干细胞定向诱导分化为胰岛β细胞的方法，包括如下步骤：1将多能干细胞形成胚胎小体；2将所述胚胎小体去甲基化处理，得到去甲基化处理后细胞；3将所述去甲基化处理后细胞依次分化为内胚层细胞、原肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞和胰岛β细胞。本研究证明了表达Pdx1‑mRFPinsulin‑hrGFP双报告基因的hiPSC系在建立及优化β细胞分化方法中具有重要价值。

主权项：1.一种使多能干细胞定向诱导分化为胰岛β细胞的方法，包括如下步骤：1将多能干细胞培养形成胚胎小体；2将所述胚胎小体去甲基化处理，得到去甲基化处理后细胞；3将所述去甲基化处理后细胞依次分化为内胚层细胞、原肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞和胰岛β细胞。

全文数据：表达PdxVinsuIiη双报告基因的诱导多能干细胞系的构建及其应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种表达Pdxlinsulin双报告基因的诱导多能干细胞系的构建及其应用。背景技术[0002]诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPSCs在体外具有自我更新和多向分化潜能。因此，在疾病模型，药物研发和再生医学等领域具有广阔的应用前景。iPSCs可由自身体细胞获得，因此，可进行自体细胞移植，避免移植排斥反应，同时也不存在伦理道德问题。近来的研究表明，iPSCs在体外能分化为其他方法难以获得的细胞类型，如神经元、视网膜和心肌等细胞。将这些细胞移植到动物疾病模型体内，疾病的症状有不同程度的缓解，如改善帕金森氏病猴子的运动功能、恢复小鼠的视力和修复心梗猴子的心脏损伤等。[0003]糖尿病的发病率正在逐年显著增加。2017年WHO报告显示，目前全球糖尿病的发病率约为8.5%，大约有4.22亿糖尿病患者。1型糖尿病是由于胰岛细胞受到自身免疫反应攻击所导致的。当残存的胰岛β细胞数量少于胰岛细胞总数的10-20%就会表现出临床症状。2型糖尿病是由于细胞增殖能力下降和细胞凋亡增加而导致细胞功能异常和进行性细胞数量减少。目前，胰岛辟田胞移植被认为是治疗糖尿病最有效的办法之一。然而，大规模胰岛β细胞移植的应用却受到细胞来源短缺和终生使用免疫抑制剂等限制。多能干细胞pluripotentstemcelIs,PSCs包括胚胎干细胞（embryonicstemcelIs,ESCs和诱导多能干细胞，具有分化为多种细胞的能力。因此，PSCs成为糖尿病的细胞治疗的理想细胞来源。PSCs分化为胰岛素分泌细胞方面的研究已经取得了显著的进展。近年来，在模式生物发育研究中确定了一些胰腺发育关键基因和信号通路，这些已经有效地应用于PSCs的分化为胰岛素分泌细胞的研究。目前，应用相似的诱导分化方法可将hESCs和hiPSCs分化为胰岛素分泌细胞。然而，细胞分化的效率在不同的细胞系中存在显著的差异，一些细胞系具有向特定细胞类型分化的倾向。这些差异可能是由于细胞的基因、表观遗传以及细胞周期模式不同所导致。由于细胞分化效率存在显著的差异性，所以优化特定细胞系向胰岛辟田胞分化是一项耗时、费力的工作。发明内容[0004]本发明的一个目的是提供一种使多能干细胞定向诱导分化为胰岛辟田胞的方法。[0005]本发明提供的方法，包括如下步骤：[0006]1将多能干细胞形成胚胎小体；[0007]2将所述胚胎小体去甲基化处理，得到去甲基化处理后细胞；[0008]3将所述去甲基化处理后细胞依次分化为内胚层细胞、原肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞和胰岛辟田胞。[0009]上述方法中，所述步骤1中，所述将多能干细胞形成胚胎小体为将多能干细胞消化后，在装有含有抑制细胞凋亡试剂的培养基的超低细胞吸附培养板中培养。[0010]上述方法中，所述抑制细胞凋亡试剂为RevitaCellsupplement;[0011]和或，所述RevitaCellsupplement在含有抑制细胞凋亡试剂的培养基中的最终浓度为1倍量。[0012]上述方法中，所述步骤2中，将所述胚胎小体去甲基化处理为将所述胚胎小体在含有去甲基化物质的培养基中培养，得到去甲基化处理后细胞。[0013]上述方法中，所述去甲基化物质为5_Aza_2’-deoxycytidine或5-Azacytidine;[0014]和或，所述5-Azacytidine在含有去甲基化物质的培养基中的浓度为2μΜ。[0015]上述方法中，步骤3中，所述将去甲基化处理后细胞分化为内胚层细胞为将所述去甲基化处理后细胞在含有ActivinA、CHIR99021和ΡΙ-103的M2细胞培养基中诱导分化培养;再在含有ActivinA的M2培养基中继续诱导分化培养；[0016]所述M2细胞培养基由如下各浓度的物质组成：体积百分含量50%IMDM、体积百分含量50%F12、质量百分含量0·1%BSA、体积百分含量1%chemically-definedlipidconcentrate、450yMmonothioglycerol和1:200稀释的ITS-X0[0017]上述方法中，所述含有ActivinA、CHIR99021和PI-103的M2细胞培养基为将ActivinA、CHIR99021、PI-103添加到M2培养基中得到的培养基；[0018]和或，所述ActivinA、CHIR99021和PI-103在含有ActivinA、CHIR99021和PI-103的M2细胞培养基中的浓度分别为100ngmL、4μΜ和IOOnM;[0019]和或，所述含有ActivinA的M2培养基中的ActivinA的浓度为100ngmL。[0020]上述步骤3将所述去甲基化处理后细胞依次分化为内胚层细胞、原肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞和胰岛辟田胞为将所述去甲基化处理后细胞进行如下5个阶段诱导培养：[0021]第1阶段:将所述去甲基化处理后细胞诱导分化培养，得到阶段1分化的细胞，即得到内胚层细胞；[0022]第2阶段:将所述阶段1分化的细胞诱导分化培养，得到阶段2分化的细胞，即得到原肠细胞；[0023]第3阶段:将所述阶段2分化的细胞诱导分化培养，得到阶段3分化的细胞，即得到胰腺前体细胞；[0024]第4阶段:将所述阶段3分化的细胞诱导分化培养，得到阶段4分化的细胞，即得到内分泌前体细胞；[0025]第5阶段:将所述阶段4分化的细胞诱导分化培养，得到阶段5分化的细胞，即得到胰岛辟田胞。[0026]第2阶段:将所述阶段1分化的细胞在KGF作用下诱导分化培养，得到阶段2分化的细胞；[0027]第3阶段:将所述阶段2分化的细胞在KGF、SANTl、RetinoicacidRA、LDN193189、和TOBu作用下诱导分化培养，得到阶段3分化的细胞；[0028]第4阶段：将所述阶段3分化的细胞在SANTl，RA，XXIγ-分泌酶抑制剂）、Alk5iII，L_3,3’，5-TriiodothyronineT3和Betacellulin作用下诱导分化培养，得到阶段4分化的细胞；[0029]第5阶段:将所述阶段4分化的细胞在RA,XXI，T3，Alk5iII和Betacellulin用下诱导分化培养，得到阶段5分化的细胞。[0030]上述方法中，所述第2阶段中诱导分化培养为将所述阶段1分化的细胞在含有50ngmLKGF的M3细胞培养基中诱导分化培养，得到阶段2分化的细胞；[0031]和或，所述第3阶段中诱导分化培养为将所述阶段2分化的细胞在含有50ngmLKGF、250nMSANTl、2yMRA、200nMLDN193189和500nMI3DBu的M4细胞培养基中诱导分化培养;再在含有50ngmLKGF、250nMSANTl和2μΜRA的M4细胞培养基中诱导分化培养，得到阶段3分化的细胞；[0032]和或，所述第4阶段中诱导分化培养为将所述阶段3分化的细胞在含有250nMSANTl、IOOnMRA、lyMXXI、ΙΟμΜAlk5iII、ΙμΜT3和20ngmLBetacellulin的M4细胞培养基中诱导分化培养，得到阶段4分化的细胞；[0033]和或，所述第5阶段中诱导分化培养为将所述阶段4分化的细胞在含有25nMRA、1μΜXXI、ΙμΜΤ3、10μΜAlk5iII和20ngmLBetacellulin的M5细胞培养中诱导分化培养；再在含有1〇μΜAlk5iII和ΙμΜT3的M6细胞培养基中诱导分化培养；[0034]和或，所述M3培养基由如下各浓度的物质和组成：MCDB131、8mMD-Glucose、1.23gLNaHC03、质量百分含量2%BSA、ITS-Xl:50,000、2mMGlutamax和0.25mMVitaminC；[0035]和或，所述M4培养基由如下各浓度的物质和组成：MCDB131、8mMD-Glucose、1.23gLNaHC03、质量百分含量2%的BSA、ITS-X1:200、2mMGlutamax和0.25mMVitaminC；[0036]和或，所述M5培养基由如下各浓度的物质和组成：MCDB131、20mMD-Glucose、1.754gLNaHC03、质量百分含量2%BSA、ITS-X1:200、2mMGlutamax和0.25mMVitaminC；[0037]和或，所述M6培养基由如下各浓度的物质和组成:CMRLmedium1066和质量百分含量10%FBS。[0038]上述方法中，所述第1阶段中，所述诱导分化培养时间为1天，所述继续诱导分化培养时间为2天；[0039]和或，所述第2阶段中，所述诱导分化培养时间为2天；[0040]和或，所述第3阶段中，所述诱导分化培养时间为5天，所述继续诱导分化培养时间为5天；[0041]和或，所述第4阶段中，所述诱导分化培养时间为4天；[0042]和或，所述第5阶段中，所述诱导分化培养时间为3天，所述继续诱导分化培养时间为15天。[0043]上述方法为3D诱导培养，均在超低细胞吸附培养板培养。[0044]由上述的方法制备的胰岛辟田胞也是本发明保护的范围；[0045]或，由上述的方法中步骤3中任一分化阶段得到的细胞也是本发明保护的范围。[0046]上述多能干细胞在定向诱导分化胰岛辟田胞中的应用也是本发明保护的范围。[0047]上述中，所述多能干细胞具体为诱导多能干细胞或者胚胎干细胞，在实施例中为MRC5-iPSCs。[0048]在本发明的实施例中，为了检测细胞的分化不同阶段，采用的多能干细胞含有表达双报告基因的载体，具体是将表达双报告基因的载体导入多能干细胞中得到的细胞；[0049]所述表达双报告基因的载体为表达Pdxlinsulin双报告基因的载体，具体的所述表达Pdxlinsulin双报告基因的载体含有1种颜色荧光蛋白和驱动所述1种颜色荧光蛋白表达启动子、另一种颜色荧光蛋白和驱动所述另一种颜色荧光蛋白表达启动子以及抗性基因和驱动所述抗性基因表达启动子，[0050]具体的，上述表达Pdxlinsulin双报告基因的载体为含有红色荧光蛋白mRFP和驱动其表达小鼠Pdxl启动子、绿色荧光蛋白hrGFP和驱动其表达大鼠insulinl启动子以及?111'〇1115^;[11抗性基因和驱动其表达的11?61启动子，具体实施例为口1'1861'-?^1-1111^?insulin-hrGFPhPGK-Puro0[0051]本发明由人胚肺成纤维细胞MRC5构建了表达Pdxl-mRFPinsulin-hrGFP双报告基因的hiPSC系，并且验证了其功能。通过实时监测辟田胞分化过程中关键性分子标志的表达，优化了细胞诱导分化方法，建立了体外高效β细胞分化方法。本研究证明了表达Pdxl-mRFPinsulin-hrGFP双报告基因的hiPSC系在建立及优化辟田胞分化方法中具有重要价值。附图说明[0052]图1为pTiger-Pdxlinsulin双报告基因载体构建及双报告基因细胞系的获得。[0053]A.pTiger-Pdxlinsulin双报告基因载体图谱。小鼠Pdxl启动子驱动mRFP表达，大鼠insulinl启动子驱动hrGFP表达，hPGK启动子驱动Puromycin抗性基因表达。B.双报告基因载体的功能确认。INS-I感染双报告基因载体后共表达RFP和GFPΙΟΟμπιA.Pdxl;[118111;[11双报告基因1?508系。1?508感染双报告基因载体后，]^81111卩111'〇1115^;[11dihydrochloride加压筛选7天（200ym。[0054]图2为体外诱导iPSCs分化为IPCsinsulin-producingcells;Α·体外生长因子和小分子化合物组合法诱导iPSCs分化为IPCs方案;双报告基因细胞系经5个阶段诱导分化为IPCsAE，内胚层细胞;PGT，原肠;PP，胰腺前体细胞;EP，内分泌前体细胞；IPCs，胰岛素分泌细胞.ActA，ActivinA;CHIR，CHIR99021;RA,Retinoicacid;LDN，LDN193189;PDBu，PhorboI-12，I3_dibutyrate;XXI，γ-secretaseinhibitor;T3，L_3，3’,5-Triiodothyronine；BTC,Betacellulin；Alk5i,Alk5receptorinhibitorII.B.qPCR检测内胚层细胞基因表达。第I阶段末，分析11、12和对照组5«17和?〇似2的表达情况。基因表达数据以GAPDH转录水平为基准进行标准化。实验结果经三次独立生物学重复确认，*p〈0.05。C.流式细胞分析。左侧为未分化的iPSCs对照组，右侧为M2组。D.免疫荧光分析内胚层细胞分子标志。细胞进行anti_Soxl71:100和anti_Foxa21:50染色（200μηιi.实时监测Pdxl和insulin的表达。荧光显微镜下每天监测RFPGFP的表达（ΙΟΟμπι上免疫荧光分析。采用相应的诱导方案平行诱导亲代iPSCs无双报告基因载体），第9天进行anti-Pdxl1:100染色（ΙΟΟμπιA.qPCR检测Pdxl的表达。在第7天和第9天，分析M2和对照组Pdxl表达情况。基因表达数据以GAPDH转录水平为基准进行标准化。实验结果经三次独立生物学重复确认，*ρ〈0·05。[0055]图3为5Aza对β细胞分化的影响;A.qPCR检测内胚层细胞基因表达。第1阶段末，分析M2、M2+5Aza和对照组Soxl7和Foxa2的表达情况。基因表达数据以GAPDH转录水平为基准进行标准化。实验结果经三次独立生物学重复确认，*P〈〇.05;**p〈0.01A.流式细胞分析。左侧为未分化的iPSCs对照组，右侧为M2+5Aza组。C.实时监测Pdxl和insulin的表达。荧光显微镜下每天监测RFPGFP的表达Days7andl6，100ym;Day34,200μηι。0·免疫焚光分析。采用相应的诱导方案平行诱导亲代iPSCs无双报告基因载体），第34天进行anti-Pdxl1:100和anti-insulin1:50染色（IOOym。[0056]图4为3D诱导提高辟田胞分化效率;A.qPCR检测内胚层细胞基因表达。第1阶段末，分析2D+5Aza、3D+5Aza和对照组Soxl7和Foxa2的表达情况。基因表达数据以GAI3DH转录水平为基准进行标准化。实验结果经三次独立生物学重复确认，*p〈〇.05;**p〈0.01。B.流式细胞分析。左侧为未分化的iPSCs对照组，右侧为3D+5Aza组。C.免疫焚光分析内胚层细胞分子标志。细胞进行anti-Soxl71:100和anti-Foxa21:50染色（200μπι。0·实时监测Pdxl和insulin的表达。荧光显微镜下每天监测RFPGFP的表达Days7and16,500μπι;Day34,200μπι免疫荧光分析。采用相应的诱导方案平行诱导亲代iPSCs无双报告基因载体），第34天进行anti-Pdxl1:100和anti-insulin1:50染色（IOOym〇[0057]图5为IPCs鉴定;A·qPCR检测Pdx1和insulin基因表达。分析2D+5Aza、3D+5Aza和对照组Pdxl和insulin在不同时间点的表达情况。基因表达数据以GAPDH转录水平为基准进行标准化。实验结果经三次独立生物学重复确认，*P〈〇.05;**p〈0.01;***P〈0.001A.RT-PCR检测β细胞相关基因。β细胞分化的〇、14、21和34天收取总RNA，并进行分析。C.ELISA检测胰岛素分泌。第34天，2D和3D方法诱导所获细胞经2和25mM葡萄糖或25mM2DG刺激后，分析胰岛素的分泌水平。胰岛素的浓度以细胞内总蛋白浓度为基准进行标准化。每次实验单独重复3次。数据为均数土标准差，每个样品重复测量3次，#*P〈0.001。具体实施方式[0058]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0059]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0060]下述实施例中部分方法如下：[0061]1、免疫荧光分析[0062]细胞首先在多聚甲醛中固定30min，4°C。而后在含0.1%TritonX-100和10%牛血清的PBS中进行破膜及封闭处理。随后一抗4°C过夜孵育，最后以荧光标记的二抗室温孵育lh。所用一抗：Anti_Soxl7RDSystems和anti_Foxa2Proteintech;anti_PdxlRDSystems和anti-insulinProteintech〇二抗：donkeyanti-mouseAF488,donkeyanti-mouseAF594,donkeyanti-rabbitAF594和donkeyanti-goatAF594Invitrogen〇[0063]2、RT-PCI^PqPCR[0064]采用TRIzol试剂由细胞中分离总RNA，DNase处理总RNA以去除基因组DNA污染。采用SuperscriptIVfirst-strandsynthesissystemInvitrogen以Iyg总RNA为模板进行反转录。采用TaqDNApolymeraseInvitrogen进行PCR扩增，反应条件如下:预变性94°C，3min，变性94°C，30s，退火56°C，30s，延伸72°C，Imin，共30个循环，终延伸72°C，IOmin。[0065]qPCR反应采用SYBRGreenPCRMasterMixAB进行，每个反应重复三次。基因表达数据以GAPDH转录水平为基准进行标准化。基因表达变化采用计算方法。实验结果经三次独立生物学重复确认。qPCR反应条件如下:预变性95°C，Imin，变性95°C，5s，退火60°C，IOs，延伸72°C，15s，共40个循环。引物见表1。[0066]表1.PCR和qPCR引物[0067][0068]3、流式细胞检测[0069]将细胞经trypsinHyClone消化后，制备成单细胞悬液;PBS清洗后，在FixationandPermeabilizationSolutionBDBiosciences中固定和破膜20miruPermWashBufferBDBiosciences清洗后，APC-conjugatedgoatanti_Soxl7RDSystems和PE-conjugatedmouseanti_Foxa2antibodiesBDBiosciences4°C孵育ItuPBS清洗后，上机流式细胞检测。相应的同型对照抗体作为阴性对照。每个样品收集20,000细胞进行分析。数据应用FCSexpress4plus软件进行分析。[0070]4、胰岛素分泌检测[0071]胰岛素静态分泌检测：将细胞I3BS清洗5次后，在含有2mM葡萄糖的Krebs-RingerbicarbonateKRBbuffer孵育Ih，收集上清，离心后保存。而后，细胞清洗3次后，在含有25mM葡萄或2-DG的KRBbuffer中孵育Ih，收集上清，离心后保存。[0072]膜岛素测定米用InsulinELISAkitAlpcoDiagnostics〇[0073]总蛋白定量米用BCAProteinAssayKitPierceBiotechnology。[0074]胰岛素的浓度以细胞内总蛋白浓度为基准进行标准化。每次实验单独重复3次。[0075]下面实施例中各个诱导分化所用分化培养基组分如下：[0076]Ml:MCDB13UGibco+8mMD-GlucoseSigma+2.46gLNaHCO3Sigma+2%质量百分含量）BSACalbiochem+ITS-XGibco1:50,000稀释50,000倍）+2mMGlutamaxGibco+0.25mMVitaminCSigmaAldrich.[0077]M2:50%MDMGibco;体积百分含量+50%F12Gibco;体积百分含量）+0.1%质量百分含量）BSA+1%体积百分含量）chemically-definedlipidconcentrateGibco+450μΜmonothioglycerolSigmaAldrich+ITS-X1:200稀释200倍）·[0078]M3:MCDB131+8mMD-Glucose+1.23gLNaHC03+2%质量百分含量）BSA+ITS-XI:50,000+2mMGlutamax+0.25mMVitaminC.[0079]M4:MCDB131+8mMD-Glucose+1.23gLNaHC03+2%BSA+ITS-Xl:200+2mMGlutamax+0.25mMVitaminC.[0080]M5:MCDB131+20mMD-Glucose+1.754gLNaHC03+2%BSA+ITS-XI:200+2mMGlutamax+0.25mMVitaminC.[0081]M6:CMRLmedium1066Gibco+10%FBSHyClone.[0082]实施例1、表达Pdxlinsulin双报告基因的诱导多能干细胞系的构建[0083]l、Pdxlinsulin双报告基因载体的构建[0084]Pdxlinsulin双报告基因载体是在FIVpTiger载体的基础上改构获得（Szabat，M.,Luciani,D.S.,Piret,J.M.Johnson,J.D.Maturationofadultbeta-celIsrevealedusingaPdxlinsulindual-reporterlentivirus.Endocrinology150,1627-1635,doi:10·1210en·2008-12242009。为在FIVpTiger载体加入药物筛选标记，首先将hPGK-Puromycin抗性基因引入载体。前期测试表明FIVpTiger载体Insl启动子的表达效率较低。为提高Ins1启动子的表达效率，以Insl-hrGFP646bpIns1启动子）替换了原来的Insl-EGFP410bpInsl启动子得到新载体pTiger-Pdxl-mRFPinsulin-hrGFPhPGK-?111'0又称为口1^861—?^1；[118111；[11双报告基因载体；图]^，口11861—?^1；[118111；[11载体图中间的名称为载体骨架FIVpTiger的名称;pTiger-Pdxlinsulin中小鼠Pdxl启动子驱动红色荧光蛋白mRFP表达，大鼠insulinl启动子驱动绿色荧光蛋白hrGFP表达，hPGK启动子驱动Puromycin抗性基因表达）。[0085]pTiger-Pdxl-mRFPinsulin-hrGFPhPGK-Puro载体详见已发表的文献：叶玲玲、李世崇、孙海燕等，高效Pdxlinsulin双报告基因载体的构建及其初步应用，中国组织工程研究，第21卷第12起2017-04-28出版，该载体的具体构建方法如下：[0086]pTiger-Pdxl-mRFPinsulin-hrGFPhPGK-Puro载体为将hPGK-Puromycin抗性基因（序列1插入到FIVpTiger载体的PmelNotl限制性酶切位点之间，且将Insl-hrGFP序列序列2;646bpInsl启动子）替换FIVpTiger载体的NheI和PmeI酶切位点间的大鼠Insl-EGFP410bpInsl启动子），得到的载体。[0087]2、表达Pdxlinsulin双报告基因慢病毒制备[0088]病毒制备的前1天，按照（4.0-5.0XIO610cm培养皿的密度接种293FT细胞Invitrogen。制备病毒当日，将表达Pdxlinsulin双报告基因载体pTiger-Pdxl-mRFPinsulin-hrGFPhPGK-Puro和包装质粒pCPRΛEnv和pCI-VSVGAddgene用脂质体Lipofectamine2000共转染293FT细胞;转染后48-72h收集含有病毒颗粒的培养基上清，1500rmin离心去除上清中悬浮的细胞及碎片；然后再以20000rmin，4°C离心2h浓缩病毒，离心后弃掉上清，用4mL培养基（高糖DMEM重悬病毒颗粒沉淀备用，得到表达Pdxlinsulin双报告基因慢病毒。[0089]将表达Pdxlinsulin双报告基因慢病毒转入INS-I细胞中，验证载体的功能。结果如图IB所示，可以看出，INS-I细胞同时表达RFPGFP，表明双报告基因载体构建成功。[0090]3、表达Pdxlinsulin双报告基因的诱导多能干细胞系的制备[0091]lMRC5_iPSCs的获得[0092]MRC5-iPSCs:由人胚肺成纤维细胞MRC5国家实验细胞资源共享平台，3111C0001CC000044感染表达0ct4、Sox2、Klf4和cMyc四个重编程因子的逆转录病毒制备获得;具体方法如下：[0093]从Addgene购买逆转录病毒表达载体pMXs_h0ct4，hSox2，hKlf4和hc-Myc，以及包装载体pCL-GagPol和pHCMV-VSV-G。5yg表达0ct4、Sox2、Klf4和cMyc的逆转录病毒载体载体骨架为pMXs、3.3ygpCL-GagPol和1.7ygpHCMV-VSV-G用TransIT"-293脂质体Mirus共同转染293FT细胞，72h后收集细胞培养基上清，经离心、浓缩后，获得表达h0ct4，hSox2，hKlf4和hc-Myc的逆转录病毒。将表达h0ct4，hSox2，hKlf4和hc-Myc的逆转录病毒感染离体MRC5细胞，感染后2-3周，经克隆分选、扩增及鉴定，最终获得MRC5-iPSCs。[0094]表达0ct4、Sox2、Klf4和cMyc的逆转录病毒载体的具体方法记载在如下文献中：TakahashiKl,TanabeK,OhnukiM,NaritaM,IchisakaT,TomodaK,YamanakaS.Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell.2007Nov30;1315:861-72。[0095]2表达Pdxlinsulin双报告基因的诱导多能干细胞系的制备[0096]MRC5_iPSCs先在不含滋养层细胞的培养系统进行适应培养以去除滋养层细胞;再将MRC5_iPSCs接种在vitronectin0·5ygcm2,Invitrogen包被的6孔板上，以Essential8E8,Invitrogen培养基进行培养；当传代细胞生长到60-70%融合时，每孔以ImL表达Pdxlinsulin双报告基因慢病毒+4mgL的polybreneSigma感染MRC5_iPSCs细胞，24h后更换新鲜培养基;在病毒感染后2天，将感染后细胞在含有lygmL嘌呤霉素的E8培养基中加压筛选7天，不含双报告基因载体的iPSCs全部死亡，存活细胞即为表达Pdxlinsulin双报告基因的诱导多能干细胞系。[0097]将筛选所获表达Pdxlinsulin双报告基因的诱导多能干细胞系在含有0.5ygmL嘌呤霉素的E8培养基扩增培养用倒置显微镜观察，结果如图1C。[0098]实施例2、表达Pdxlinsulin双报告基因的iPSCs体外定向分化为胰岛辟田胞[00"]为验证Pdxlinsulin双报告基因细胞系体外实时监测细胞分化的功能，采用生长因子和小分子化合物组合法诱导细胞向胰岛辟田胞分化图2A。[0100]模拟胚胎胰腺发生策略，诱导iPSCs经5个阶段分化为胰岛素分泌细胞：内胚层阶段1、原肠阶段2、胰腺前体细胞阶段3、内分泌前体细胞阶段4和胰岛素分泌细胞阶段5。[0101]—、第1阶段诱导培养基的优化[0102]1、第1阶段M2培养基优化诱导分化[0103]优化前Ml培养基组第1阶段：iPSCs分化成内胚层细胞（Definitiveendoderm，DE:将实施例1获得的表达Pdxlinsulin双报告基因的iPSCs培养至50-60%融合时，PBS洗一次，在含有100ngmLActivinARD，4yMCHIR99021Stemgent和IOOnMPI-103Selleckchem的Ml培养基中诱导分化培养1天；随后，在含有100ngmLActivinA的Ml培养基中继续诱导分化培养2天，得到Ml培养基处理阶段1分化的细胞即为DE细胞）。[0104]将Ml培养基处理阶段1分化的细胞和表达Pdxlinsulin双报告基因的iPSCs未处理的对照组进行qRCR检测Soxl7和Foxa2表达水平。[0105]结果如图2B所示，与未处理的对照组相比，Ml培养基处理阶段1分化的细胞中Soxl7和Foxa2表达水平显著上升。[0106]上述Ml培养基组阶段1分化的细胞继续培养，在细胞诱导分化第4天起，意外地发现大量细胞死亡。有报道提示在DE诱导分化过程中，高浓度ActivinA处理细胞会增加细胞凋亡和细胞活性降低，通过优化诱导条件能够保持细胞活性。为提高细胞的存活率，优化了阶段1的诱导条件，用M2培养基替换了Ml培养基。[0107]优化后M2培养基组第1阶段:与Ml培养基组方法基本相同，不同的是将优化前第1阶段中Ml培养基替换为M2培养基，其余方法相同，得到M2培养基组中阶段1分化的细胞。[0108]qRCR检测M2培养基组中阶段1分化的细胞和Ml培养基组中阶段1分化的细胞，结果如图2B所示，显示M2培养基组和Ml培养基组的Soxl7和Foxa2表达水平无显著差异。[0109]流式检测M2培养基组中阶段1分化的细胞M2，结果如图2C所示，显示M2培养基组处理3天后细胞中Soxl7和Foxa2双阳性细胞的比例约为90%。[0110]免疫荧光分析M2培养基组中阶段1分化的细胞，结果如图2D所示，M2培养基处理3天后细胞表达5«17和?《32。[0111]尤为重要的是M2培养基组在细胞诱导分化第4天起，镜下观察到细胞存活率有显著提高，未见上述Ml培养基组出现的细胞大量死亡现象。[0112]上述结果表明，M2培养基更适用于诱导iPSCs分化为DE细胞。[0113]2、继续诱导分化[0114]第2阶段：内胚层细胞Definitiveendoderm，DE诱导分化为原肠（primitiveguttube，PGT[0115]将上述一获得的M2培养基组阶段1分化的细胞在含有50ngmLKGFPeprotech的M3培养基中诱导分化培养2天，得到阶段2分化的细胞。[0116]第3阶段:胰腺前体细胞pancreaticprogenitors，PPl和PP2:[0117]将上述获得的阶段2分化的细胞在含有50ngmLKGF，250nMSANTlSigma，2μΜRetinoicacidRA，Sigma，200nMLDN193189仅第6天，Selleckchem和500nMPDBuCalbiochem的Μ4培养基中诱导分化培养2天;再在含有50ngmLKGF，250nMSANTl和2μΜRA的Μ4培养基中诱导分化培养5天，得到阶段3分化的细胞。[0118]在上述诱导第2-3阶段中，DE细胞在狀？、34犯1、1^、1^193189和?0811作用下，依次诱导细胞向PGT和PPs分化，并以Pdxl-mRFPinsulin-hrGFP的表达作为标志荧光显微镜监测PPs的形成（图1A，直至第9天才观察到Pcbd-mRFP的表达，提示Pdxl延迟表达（图2E。免疫荧光分析确认了Pdxl的表达（图2F^PCR结果显示Pdxl的表达伴随细胞分化无明显变化图2G。这些结果提示细胞延迟表达Pdxl，而且表达水平随时间无明显变化。因此，诱导分化方案需要进一步优化。[0119]二、5Aza预处理+M2培养基诱导分化[0120]A、M2+5Aza组：[0121]l、5Aza预处理[0122]将实施例1获得的表达PdxIinsulin双报告基因的iPSCs在含有2μΜ5-Azacytidine5Aza,Sigma的Ε8培养基中培养18h，得到5Aza处理后细胞。[0123]2、诱导分化[0124]第1阶段：iPSCs分化成内胚层细胞Definitiveendoderm，DE:[0125]按照上述一的优化后M2培养基组第1阶段进行实验，得到M2培养基组中阶段1分化的细胞；[0126]第2阶段：内胚层细胞Definitiveendoderm，DE诱导分化为原肠（primitiveguttube，PGT[0127]将上述一获得的M2培养基组阶段1分化的细胞在含有50ngmLKGF的M3培养基中诱导分化培养2天，得到阶段2分化的细胞。[0128]第3阶段:胰腺前体细胞pancreaticprogenitors，PPl和PP2:[0129]将上述获得的阶段2分化的细胞在含有50ngmLKGF，250nMSANTl，2yMRA，200nMLDN193189仅第6天）和500nMPDBu的M4培养基中诱导分化培养2天；再在含有50ngmLKGF，250nMSANTl和2μΜRA的M4培养基中诱导分化培养5天，得到阶段3分化的细胞。[0130]第4阶段：内分泌前体细胞endocrineprogenitors，EP:[0131]将上述获得的阶段3分化的细胞在含有250nMSANTl，100nMRA,ΙμΜXXICalbiochem，ΙΟμΜAlk5i11Calbiochem，ΙμΜL_3,3’,5-TriiodothyronineT3,Calbiochem和20ngmLBetacellulinRD的M5培养基中诱导分化培养4天，得到阶段4分化的细胞。[0132]第5阶段:胰岛素分泌细胞（insulin-producingcells，IPCs:[0133]将上述获得的阶段4分化的细胞在含有25nMRA,ΙμΜXXI，ΙμΜT3,ΙΟμΜAlk5iII和20ngmLBetacellulin的Μ5培养中诱导分化培养3天;再在含有10μΜAlk5iII和ΙμΜΤ3的16培养基中诱导分化培养15天，得到阶段5分化的细胞即为胰岛辟田胞）。[0134]B、5Aza未处理组M2组）：与A组不同的是，不进行5Aza处理。[0135]C、对照组control:以实施例1获得的表达Pdxlinsulin双报告基因的iPSCs为对照。[0136]qRCR检测M2+5Aza组中阶段1分化的细胞，结果如图3A所示，与control对照组相比，M2+5Aza组中阶段1分化的细胞Soxl7和Foxa2的表达显著上调；而与未进行5Aza处理的M2组对照组中阶段1分化的细胞比较，表达无明显差异。[0137]流式检测M2+5Aza组中阶段1分化的细胞，结果如图3B所示，M2+5Aza组中阶段1分化的细胞Soxl7和Foxa2双阳性细胞的比例约为90%，与未进行5Aza处理的M2组对照组中阶段1分化的细胞相似图2C。[0138]上述结果提示5Aza预处理对DE的形成无明显作用。[0139]随后，荧光显微镜下每天监测RFPGFP的表达继续监测PPs的形成，正如所预期，诱导分化培养第7天，观察到Pdxl-mRFP阳性克隆，比5Aza未处理的M2组早2天，提示有效地诱导PPs的形成（图3C;诱导分化培养第16天，发现Pdxl-mRFPinsulin-hrGFP双阳性克隆出现，提示细胞表达Pdxl和insulin图3C。此后，Pdxlinsulin双阳性克隆随时间延长逐渐生长图3C。诱导分化培养第34天，免疫荧光分析确认了Pdxl和insulin的表达图3D。[0140]三、5Aza预处理+M2培养基+3D诱导[0141]I、诱导分化[0142]在细胞向PPs分化过程中，注意到Pdxl-mRFPinsulin-hrGFP阳性克隆倾向于形成团块状或3维3D样结构，很少散在分布。这些现象提示细胞与细胞之间的相互作用可能在β细胞分化中具有重要作用。因此，认为3D诱导可能会进一步提高细胞的分化效率。为与随后的3D的诱导方法相区别，将上述二的诱导方法称之为2D诱导。[0143]八、30组（30+5八2:[0144]I、RVC处理[0145]将实施例1获得的表达Pdxlinsulin双报告基因的iPSCs经0.5mMEDTA消化后，接种在24孔超低吸附培养板上，培养在添加IXRevitaCellsupplementRVC，Gibco的E8培养基中，以形成胚胎小体embryonicbodies，EBs;3天后，转移EBs至超低吸附培养板的新孔，得到RVC处理后细胞胚胎小体细胞;图4D，Day7的phase图片可看出胚胎小体细胞）。[0146]2、将上述1得到的RVC处理后细胞按照上述二中的A组进行诱导分化，不同的是整个试验都是在24孔超低吸附培养板进行。[0147]B、2D组（2D+5Aza:以上述二A组方法诱导细胞分化2D诱导，图3C，Day7的phase图片可看出2D诱导细胞）。[0148]C、对照组：以实施例1获得的表达Pdxlinsulin双报告基因的iPSCscontrol组）为对照。[0149]qPCR检测3D组中阶段1分化的细胞中基因的表达，Soxl7和Foxa2表达在3D和20组之间无明显差别（图4A。[0150]流式细胞检测3D组中阶段1分化的细胞，与2D组相比，3D组Soxl7和Foxa2双阳性细胞的比例稍有升高，但无统计学意义，约为95%图4B。[0151]免疫荧光检测3D组中阶段1分化的细胞，确认了Soxl7和Foxa2的表达图4C。[0152]上述结果提示3D诱导不能进一步提高DE的形成效率，这主要是由于DE的分化效率在2D诱导中已经非常高了。[0153]荧光显微镜下每天监测第2-3阶段RFPGFP的表达，与2D组相似，在第3阶段末Pdxl-mRFP阳性克隆开始出现，但是分化效率显著提高（图4D。诱导分化培养第16天，观察到卩^1-1111^3;[118111;[11-1^6??双阳性克隆出现，提示细胞表达?^1和;[118111;[11，而且分化效率也显著提高（图4D。这些双阳性克隆随时间延长迅速生长图4D。[0154]免疫荧光分析诱导分化培养第34天确认了Pdxl和insulin的表达图4E。[0155]Π、辟田胞相关特性检测[0156]l、qPCR检测[0157]qPCR检测2D组和3D组不同诱导分化时间Pdxl和insulin表达的变化，结果如图5A显示，与2D组相比，3D组的Pdxl和insulin表达水平在不同时间点都显著升高，具有统计学意义;从诱导分化培养第7天至14天，3D诱导组的Pdxl表达水平逐渐升高，而后一直维持较高的表达水平直至第34天。2D和3D组的insulin的表达水平随时间延长也分别显著升高，而且，与2D组相比，3D诱导组第16天至34天的insulin表达水平升高的更显著。[0158]2、RT-PCR检测[0159]RT-PCR检测3D组不同诱导分化时间辟田胞特异性基因的表达，结果如图5B所示，3D组在阶段5分化的细胞（诱导分化第34天）表达β细胞特异性基因Nkx6.1、Ngn3、Nkx2.2和MAFA，P细胞功能相关基因PCSKlPCl、PC2、Kir6.2、Surl和glucosetransporter2Glut2，提示细胞获得较成熟的生理功能。同时，注意到细胞还表达其他胰岛细胞激素基因glucagonGcg、somatostatinSstpancreaticpolypeptidePpy，提不3Di秀导所获细胞仍含有多种类型细胞。[0160]3、胰岛素分泌检测[0161]细胞最重要的表型特征之一就是合成和处理胰岛素不成熟的细胞和葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌成熟的辟田胞）。[0162]采用ELISA方法检测了2D组和3D组诱导分化培养第34天的细胞，具体方法如下:将诱导分化培养第34天的细胞在2mM葡萄糖或25mM葡萄糖刺激Ih后，收集培养上清，并进行了检测。以用25mM非代谢性的葡萄糖类似物2de〇Xy-D-gluC〇se2-DG刺激Ih作为对照（为排除渗透压对胰岛素分泌的影响）。[0163]结果如图5C所示，与2D组相比，3D组的IPCs在高浓度的葡萄糖刺激下，胰岛素的分泌显著增加p〈0.001;而2D组的胰岛素分泌只是有略有升高趋势p0.05;2-DG不能刺激胰岛素分泌。[0164]上述实验结果提示3D组诱导使细胞获得了成熟的生理功能，这些细胞能够偶联葡萄糖的感知、摄取和代谢过程与胰岛素的合成、处理和释放过程，这些结果与前述的RT-PCR分析是一致的。

权利要求：1.一种使多能干细胞定向诱导分化为胰岛辟田胞的方法，包括如下步骤：1将多能干细胞培养形成胚胎小体；2将所述胚胎小体去甲基化处理，得到去甲基化处理后细胞；3将所述去甲基化处理后细胞依次分化为内胚层细胞、原肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞和胰岛辟田胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中，所述将多能干细胞培养形成胚胎小体为将多能干细胞消化后，在装有含有抑制细胞凋亡试剂的培养基的超低细胞吸附培养板中培养。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述抑制细胞凋亡试剂为RevitaCellsupplement。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2中，将所述胚胎小体去甲基化处理为将所述胚胎小体在含有去甲基化物质的培养基中培养，得到去甲基化处理后细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述去甲基化物质为5~Aza_2’-deoxycytidine或5-Azacytidine;和或，所述5-Azacytidine在含有去甲基化物质的培养基中的浓度为2μΜ。6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤3中，所述将去甲基化处理后细胞分化为内胚层细胞为将所述去甲基化处理后细胞在含有ActivinA、CHIR99021和ΡΙ-103的M2细胞培养基中诱导分化培养；再在含有ActivinA的M2培养基中继续诱导分化培养；所述M2细胞培养基由如下各浓度的物质组成：体积百分含量50%IMDM、体积百分含量50%F12、质量百分含量0.1%BSA、体积百分含量l%chemically_definedlipidconcentrate、450yMmonothioglycerol和1:200稀释的ITS-X07.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述含有ActivinA、CHIR99021和PI-103的M2细胞培养基为将ActivinA、CHIR99021、PI-103添加到M2培养基中得到的培养基；和或，所述ActivinA、CHIR99021和PI-103在含有ActivinA、CHIR99021和PI-103的M2细胞培养基中的浓度分别为100ngmL、4μΜ和IOOnM;和或，所述含有ActivinA的M2培养基中的ActivinA的浓度为100ngmL。8.由权利要求1-7中任一所述的方法制备的膜岛β细胞；或，由权利要求1-7中任一所述的方法中步骤3中依次分化阶段得到的细胞。9.多能干细胞在定向诱导分化胰岛β细胞中的应用。10.根据1-7中任一所述的方法或权利要求9所述的应用，其特征在于:所述多能干细胞为诱导多能干细胞或者胚胎干细胞；或，所述多能干细胞为含有表达双报告基因的载体的细胞；或，所述含有表达双报告基因的载体的细胞为将表达Pdxlinsulin双报告基因的载体导入多能干细胞中得到的细胞；或，所述表达Pdxlinsulin双报告基因的载体含有1种颜色荧光蛋白和驱动所述1种颜色荧光蛋白表达启动子、另一种颜色荧光蛋白和驱动所述另一种颜色荧光蛋白表达启动子以及抗性基因和驱动所述抗性基因表达启动子。

百度查询： 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 表达Pdx1/insulin双报告基因的诱导多能干细胞系的构建及其应用