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申请/专利权人：中国科学院海洋研究所

摘要：本发明属于海洋动物功能基因和免疫活性蛋白领域，具体涉及一种重组的长牡蛎CgC1qDC‑3蛋白及其制备和应用。重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述重组CgC1qDC‑3蛋白在制备高亲和力特异识别脂多糖LPS的药物中的应用。本发明重组的CgC1qDC‑3蛋白，可以特异的识别革兰氏阴性菌的病原体相关分子模式脂多糖LPS，对LPS结合亲和力较强平衡解离常数KD＝8.74×10‑7M。利用本发明获得的重组蛋白可用于病原菌识别或者脂多糖LPS竞争结合制剂的研发。

主权项：一种重组的长牡蛎CgC1qDC‑3蛋白的应用，其特征在于：重组CgC1qDC‑3蛋白在制备高亲和力特异识别脂多糖LPS的药物中的应用。

全文数据：一种重组的长牡蛎CgG1qDC-3蛋白的应用技术领域[0001]本发明属于海洋动物功能基因和免疫活性蛋白领域，具体涉及一种重组的长牡蛎CgClqDC-3蛋白的应用。背景技术[0002]含有与补体Clq分子类似的Clq球状结构域的蛋白，统称为ClqDC蛋白（Clqdomaincontainingprotein，ClqDC蛋白在免疫应答过程中发挥重要作用。在脊椎动物中，ClqDC蛋白主要通过参与补体系统经典途径的激活而发挥免疫作用。在无脊椎动物中，ClqDC蛋白的功能趋于多样化。目前发现无脊椎动物ClqDC具有凝集微生物的活性，存在凝集素进化的痕迹;部分ClqDC能与热聚合的人IgG分子相互作用，为补体经典途径的进化提供了有力证据。但是目前的研宄显示，ClqDC蛋白在无脊椎动物中主要作为模式识别受体Patternrecognitionreceptors，PRRs，能识别多种的病原体相关分子模式Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs，调理病原菌引发吞噬作用，从而达到清除病原体的目的。[0003]目前发现ClqDC蛋白广泛存在于哺乳动物、低等脊椎动物和无脊椎动物，广谱性或特异性识别PAMPs，介导下游的病原菌和凋亡细胞的清除、促进细胞吞噬、细胞趋化、细胞黏附、炎症及氧化应激等重要的免疫反应过程。但是对ClqDC蛋白的PAMPs结合特异性、结合强度及不同ClqDC蛋白的功能差异的研宄相对匮乏。发明内容[0004]本发明的目的是提供一种重组的长牡蛎CgClqDC-3蛋白的应用。[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：[0006]一种重组的长牡蛎CgClqDC-3蛋白的应用，重组CgClqDC-3蛋白在制备高亲和力特异识别脂多糖LPS的药物中的应用。[0007]所述重组的长牡蛎CgClqDC-3蛋白的获得：[0008]1以长牡蛎cDNA为模板，采用P1和P2为引物进行PCR扩增，待用；[0009]2PCR扩增产物与pMD19-T载体连接，而后将连接产物与原核表达载体经EcoRI，BamHI双酶切后经过T4连接酶连接；[0010]3将上述构建载体转入菌株中进行诱导培养，而后纯化、透析、冻干，即得到重组CgClqDC-3蛋白；[0011]所述引物P1和P2分别为：[0012]Pl:5’-CGCGGATCCATTCCMTAAACACCATCTCC-3’；[0013]P2:5’-CCGGAATTCTTAGGATAGTTTGAAGCCGGAG-3’。[0014]所述步骤2原核表达载体为pET-30a+;菌株为大肠杆菌TransettaDE3。[0015]所述步骤3经诱导培养后采用镍柱纯化获得可溶性重组蛋白，而后透析除盐、冻千。[0016]所述采用镍柱纯化过程:采用镍琼脂糖凝胶FF装柱将经破碎后诱导培养物上柱，在以21^111丨11-1流速用了83缓冲液（1〇11^113-此1，15〇1111恥：14117.4平衡清洗2-5个床体积，再以流速为2mLmin_1流速用含l〇mM的咪唑的TBS缓冲液（l〇mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.4进行漂洗，收集洗脱峰流出液，最后以流速为lmLmiiT1流速用含250mM的咪唑的TBS缓冲液l〇mMTris-HC1，150mMNaCl，pH7•4进行洗脱，收集洗脱峰流出纯化蛋白。[0017]所述重组蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。[0018]本发明所具有的优点:本发明以长牡蛎为研究对象，利用分子生物学、免疫学等手段，获得长牡蛎ClqDC重组蛋白，所得重组蛋白可作为PRRs特异性识别LPS，且结合力较强，在监控革兰氏阴性菌入侵的过程中发挥重要作用。对长牡蛎ClqDC分子生物学功能的研宄，本发明ClqDC重组蛋白的PAMPs结合活性、结合特异性与其病原识别功能的联系，其可以特异的识别病原相关分子模式脂多糖LPS，对LPS结合亲和力较强（平衡解离常数Kd二8.74X10_7M;并且其进一步的掲示无脊椎动物ClqDC分子在免疫系统中识别及清除病原的规律，最终为其应用于病害防控、药物研发提供理论指导。附图说明[0019]图1为本发明实施例提供的表达和纯化的长牡蛎CgClqDC-3重组蛋白电泳图，其中，M:蛋白Marker;Lane1:加入IPTG诱导的表达产物；Lane2:未加IPTG诱导的表达产物；Lane3:纯化的重组蛋白。[0020]图2为本发明实施例提供的SPR分析重组蛋白对多种PAMPs的结合活性图，其中，Control，对照;LPS，脂多糖;PGN，肽聚糖;Glucan，葡聚糖;LTA，脂磷壁酸;MAN，甘露糖；PolyI:C，聚肌苷酸-聚胞苷酸。[0021]图3为本发明实施例提供的SPR测定重组蛋白对LPS的动力学结合曲线图，其中，RU，反应单位。（CgClqDC-3重组蛋白对LPS结合的平衡解离常数为Kd=8.74X1T7M。）具体实施方式[0022]下面的实施例中将对本发明作进一步说明，但本发明不限于此。[0023]实施例1长牡蛎CgClqDC-3重组蛋白的构建：[0024]1•重组载体的构建:本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pET-30a㈩原核表达载体。通过PCR技术，模板为长牡蛎cDNA，使用3’和5’末端分别添加了Ec〇RI，BamHI特定酶切位点的基因特异性引物P15’-CGCGGATCCATTCCAATAAACACCATCTCC-3’）和P25’-CCGGAAITCTTAGGATAGTTTGAAGCCGGAG-3’）扩增长牡蛎CgClqDC-3蛋白基因编码区。反应条件为:首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环：94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共进行35个循环，最后72°C延伸10分钟。将PCR产物纯化回收，与PMD19-T载体连接。转化后，挑取单克隆利用载体引物进行菌落PCR筛选并测序，验证测序正确后用质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒大连宝生物工程有限公司），待用;使用EcoRI，BamHI双酶切阳性克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒大连宝生物工程有限公司）对酶切产物纯化回收;纯化片段与经EcoRI，BamHI双酶切的表达载体PET-30a+连接，完成载体的构建。[0025]所述引物P1和P2分别为：[0026]P1:5’-CGCGGATCCAITCCAATAAACACCATCTCC-3’；[0027]P2:5,—CCGGAATTCTTAGGATAGTTTGAAGCCGGAG-3’。[0028]2.重组蛋白的表达：以TranssetaDE3为重组表达菌株，将上述构建的重组载体转化到表达宿主菌，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取阳性单克隆，接种于6mLLB液体培养基中，37°C在摇床中剧烈震荡培养12-16小时，然后以1:100的比例接种于400mLLB液体培养基中，37。3培养至OD6〇q=〇.4-〇.8。加入IPTG，使终浓度达到lmMmL，16°C，120rpm继续过夜培养20h。4°C，8000rpm，离心lOmin，收集菌体，于-80°C冻存备用。取lmL菌液离心，弃去上清后，加入8〇uLTBS缓冲液和20uL5X蛋白上样缓冲液常规通用试剂），100°C沸水煮沸10分钟，SDS-PAGE检测诱导表达产物。[0029]3.重组蛋白的纯化与浓缩:将上述所得诱导蛋白采用镍琼脂糖凝胶FF纯化获得了可溶重组蛋白，透析到TBS缓冲液除盐和咪唑，即获得SEQIDNO.1所示的重组蛋白。[0030]所述蛋白纯化方法具体操作步骤如下：[0031]镍琼脂糖凝胶FF色谱分离带His标签的重组蛋白：[0032]1镍琼脂糖凝胶FF装柱，1•6X20cm，柱床体积为lOmL;[0033]⑵用TBS缓冲液（10mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.4;平衡2_5个床体积，流速为2mLmin_1;[0034]3将20mL含细菌破碎物的TBS缓冲液（10mMTris-HCl，l5〇mMNaCl，pH7.4上清液经0.45um滤膜过滤，上样，流速为lmLmin1;[0035]⑷用TBS缓冲液（10mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.4再洗2-5个床体积，流速为2mLmin_1;[0036]5用含10mM的咪唑的TBS缓冲液（10mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.4进行漂洗，流速为2mLmirT1，收集洗脱峰流出液；[0037]6用含250mM的咪唑的TBS缓冲液（10mMTris_HCl，150mMNaCl，pH7.4进行洗脱，流速为lmLmirT1，收集洗脱峰流出液，用SDS-PAGE检测流出液所含蛋白。表达和纯化结果如图1:M:蛋白Marker;Lane1:加入IPTG诱导的表达产物;Lane2:未加IPTG诱导的表达产物;Lane3;纯化的重组蛋白；[0038]⑺用30%异丙醇流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇保存柱子。[0039]SEQIDN0.1[0040]IPINTISKHKTLVYDRVETNAGKGYDARSGQFTAPESGLYVFHTSTTAQDKSHSTIEVVKNGEVKDMSffADAMEHIDRAVASTMTILSLTKGDIVSVRVGITYGGNLLESDQYTRMSFSGFKLS[0041]a序列特征：[0042]•长度：124个氨基酸[0043]•类型：蛋白[0044]鲁链型:单链[0045]⑹分子类型：双链DNA[0046]c假设:否[0047]d反义:否[0048]e最初来源:长牡蛎[0049]⑴特异性名称:无[00S0]结构特征:为一个只含单巨球头状ciq结构域的蛋白。[0051]实施例2CgClqDC-3重组蛋白PAMPs结合活性分析：[0052]用表面等离子共振技术（BIAcoreT200SPRinstrument，GEHealthcare检测实施例1所得CgClqDC-3重组蛋白对病原相关分子模式PAMPs的结合。[0053]HBS-EP缓冲液（GEHealthcarepH=7.5作为实验运行的工作液（含10mM冊卩£3、1501111«恥：1、3111]\1叨14和0.005%卜八表面活性剂？20，101111«的甘氨酸-盐酸盐?11=1.5作为洗涤液。首先，根据AmineCouplingKitGEHealthcare的指示将抗His标签抗体共价固定在CM5芯片表面。PAMPs包括LPS，LTA，GLU，PolyI:C和MAN，用工作液配备为^OugmU根据实验程序配备定量的配体CgClqDC-3重组蛋白和样品PAMPs加入对应的孔槽，本实施例用到CgClqDC-3重组蛋白（100ugmL体积284yL，LPS，LTA，GLU，PolyI:^PMAN体积均58此，58此工作液对照），420此洗涤液加入相应的仪器孔槽。捕获配体08：19〇03重组蛋白时，液流系统流速为l〇yLmin，反应时间为90s;PAMPs上样时，液流系统流速为lOuLmin，反应时间为120s;洗涤时，液流系统流速为30uLmin，反应时间为35s参见图2。[0054]结合反应结果如图2所示，结果显示CgClqDC-3重组蛋白特异性结合LPS，其反应单位超过180肋，而不结合其他?六1^31^六，010]，？〇171:：和嫩必。[0055]实施例3CgClqDC-3重组蛋白对LPS的结合力分析：[0056]在BIAcoreT200SPR仪上开启动力学检测程序测定上述获得CgClqDC-3重组蛋白对LPS结合的动力学曲线。CgClqDC-3重组蛋白（100ugmL383uL，浓度为〇,6.25ugmL，12.5ygmL，25ygmL，50ygmL，100ugmL的LPS各88yL，实施例2工作液88wL，洗涤液537uL加入对应孔槽，运行实验程序，得到CgClqDC-3重组蛋白对LPS结合的动力学曲线如图3所示。利用分析软件BIAcoresoftware的l:lLangmuirbinding模型对动力学曲线拟合，得出CgClqDC-3重组蛋白对LPS结合的平衡解离常数为Kd=8.74X1T7M，结合力较强。

权利要求：1.一种重组的长牡蛎CgClqDC-3蛋白的应用，其特征在于：重组CgClqDC-3蛋白在制备高亲和力特异识别脂多糖LPS的药物中的应用。2.按权利要求1所述的重组的长牡蛎CgC1qDC-3蛋白的应用，其特征在于：1以长牡蛎cDNA为模板，采用P1和P2为引物进行PCR扩增，待用；2PCR扩增产物与pMDl9_T载体连接，而后将连接产物与原核表达载体经EcoRI，BamHI双酶切后经过T4连接酶连接；3将上述构建载体转入菌株中进行诱导培养，而后纯化、透析、冻干，即得到重组CgClqDC-3蛋白；所述引物P1和P2分别为：Pl:5’-CGCGGATCCATTCCAATAAACACCATCTCC-3’；P2:5’-CCGGAATTCTTAGGATAGTTTGAAGCCGGAG-3’。3.按权利要求2所述的重组的长牡蛎CgClqDC-3蛋白的应用，其特征在于:所述步骤2原核表达载体为pET-30a+;菌株为大肠杆菌TransettaDE3。4.按权利要求2所述的重组的长牡蛎CgClqDC-3蛋白的应用，其特征在于:所述步骤3经诱导培养后采用镍柱纯化获得可溶性重组蛋白，而后透析除盐、冻干。5.按权利要求2所述的重组的长牡蛎CgC1qDC-3蛋白的应用，其特征在于:所述采用镍柱纯化过程:采用镍琼脂糖凝胶FF装柱将经破碎后诱导培养物上柱，在以2mLmirT1流速用TBS缓冲液平衡清洗2-5个床体积，再以流速为2mLmin—1流速用含l〇mM的咪唑的TBS缓冲液进行漂洗，收集洗脱峰流出液，最后以流速为lmLmirT1流速用含250mM的咪唑的TBS缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰流出纯化蛋白。6.按权利要求1所述的重组的长牡蛎CgClqDC-3蛋白的应用，其特征在于:所述重组蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

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