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申请/专利权人：广东省实验动物监测所

摘要：本发明公开了一种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测方法及引物。其操作简单：只需PCR反应之前加荧光饱和染料即可；检测速度快且高通量：全部操作过程只需2小时，极大缩短了分型所需时间；费用低，不需要特异性荧光标记探针；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

主权项：一种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：P1: GACCTYACWGCTTSCATGAT（SEQ ID NO：1）；P2: GTGWGGYTGACAAAATCCWACTT（SEQ ID NO：2）。

全文数据：一种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测方法及引物技术领域[0001]本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测方法及引物。背景技术[0002]小鼠细小病毒属于细小病毒属的单股负链DNA病毒，在普通级小鼠中感染率较高。MVM株首次发现于1966年，在后续研究中发现该病毒株在生物体内有抑制肿瘤的作用;起初被认为是孤立的细小病毒株的MPV株最早是在1933年从L3杀伤性T淋巴细胞中分离出来的。MVM株和MPV株和其他的细小病毒一样具有强的物理稳定性，对酸碱、温度等有一定的耐受能力。在生物制品的生产中，许多生物制品所用的细胞系来源于鼠源细胞如中国仓鼠卵巢细胞CHO、乳仓鼠肾细胞等，而这些细胞容易受细小毒株污染。自然感染细小病毒的鼠群通常是无症状的，但研究表明幼鼠及免疫不全的鼠感染MVM株出现矮小症，突发死亡及造血功能障碍等。相比MVM株感染，研究报道实验室和自然感染MPV株的小鼠均无病理状态。由于临床感染的症状弱或无症状以及细小病毒强的生存力，使其成为目前动物屏障设施中一种很难根除的病原。[0003]体外检测小鼠细小病毒株的方法有多种，如ELISA、感染实验、血凝实验，免疫荧光法、PCR方法等。鉴于感染后一些未能发生血清转换的小鼠则无法通过血清抗体检测，因而快速、灵敏的PCR检测方法被常用于细小病毒的日常检测。细小病毒的组织嗜性广泛，在小鼠肝、肾、脾、盲肠内容物、粪便中等均能检测病毒。目前已有的PCR检测方法有单独检测MVM株或MPV株，检测两种毒株但不区分是哪种毒株，所以迫切需要一种既可检测两种小鼠细小毒株又能够鉴别是MVM株还是MPV株的检测方法。发明内容[0004]本发明的目的在于提供一种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测方法及引物。[0005]本发明所采取的技术方案是：[0006]一种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：[0007]PI:GACCTYACffGCTTSCATGATSEQIDN0：1；[0008]P2:GTGWGGYTGACAAAATCCWACTUSEQIDN0:2。[0009]一种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测试剂盒，该试剂盒含有上述的引物。[0010]—种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的的HRM检测方法，包括以下步骤：[0011]1从样品中提取病毒核酸；[0012]2以核酸为模板，利用上述引物对Pl和P2以及荧光饱和染料，进行扩增反应获得扩增产物；[0013]3对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型。[0014]优选的，步骤2中扩增反应体系如下：[0015]PremixEx-TaqIOpL[0016]引物Pl0.5pL[0017]引物P20.5pL[0018]LCgreen染料IyL[0019]模板I11L[0020]ddH2〇7pL[0021]总体积20此。[0022]优选的，步骤2中扩增反应程序如下:94°C预变性3min;94°C变性30s，55°C退火3〇8,72°：延伸358;循环35次；72°：终延伸511^11。[0023]优选的，步骤3中HRM分析仪器熔解温度设定是以每步升温0.3°C的速率从80°C到90°C进行荧光信号的收集。[0024]优选的，步骤3中HRM分析的具体分析过程:在80-90°C熔解温度范围内，若待检测样品熔解曲线有两个熔解区间即峰型曲线有两个熔解峰时，判定该样品为小鼠细小病毒MVM株;只有一个熔解峰的判定为小鼠细小病毒MPV株。[0025]优选的，步骤3中HRM分析的具体分析过程:在99%的置信区间内，当检测样品含有2个熔解峰时，若2个熔解峰的Tm值分别为84.63±0.42°C、86.76±0.36°C，且二者差值的绝对值为2.13±0.08°C，则判定该样品为小鼠细小病毒MVM型毒株；当检测样品只有1个熔解峰，熔解Tm值为85.4±0.36°C时，则判定为小鼠细小病毒MPV型毒株。[0026]本发明的有益效果是：[0027]1本发明首次建立了一种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测方法及引物，只需PCR体系中加入荧光饱和染料进行常规PCR反应;检测速度快，全部操作过程只需2小时；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料用量少;可以简单、快速的实现高通量分析，适合于小鼠细小病毒筛查。[0028]2本发明的PCR-HRM引物，对小鼠细小病毒MVM株与MPV株均有很好的扩增性，PCR扩增效率高，检测灵敏度相当于荧光定量PCR。[0029]3本发明的PCR-HRM弓丨物特异性好，能够特异性扩增小鼠细小病毒DNA而不扩增小鼠常见的其他病毒性和细菌病原，保证了本方法的可靠性。附图说明[0030]图1为小鼠细小病毒MVM株与MPV株标准样品HRM标准化熔解曲线；[0031]图2为小鼠细小病毒MVM株与MPV株标准样品HRM峰型化熔解曲线；[0032]图3为小鼠细小病毒MVM株与MPV株临床样品HRM标准化熔解曲线；[0033]图4为小鼠细小病毒MVM株与MPV株临床样品HRM峰型化熔解曲线；[0034]图5为特异性试验凝胶电泳图。具体实施方式[0035]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不局限于此。[0036]实施例1特异性引物的设计[0037]本发明设计可以同时检测小鼠细小病毒MVM株与MPV株的引物;并对所设计的引物做大量的实验筛选，筛选出一对特异性强的引物，其核苷酸序列如下所示：[0038]Pl：GACCTYACffGCTTSCATGATSEQIDN0：1；[0039]P2:GTGffGGYTGACAAAATCCffACTTCSEQIDNO：2；[0040]引物所扩增片段长度均为516bp。[0041]实施例2标准样品的制备及PCR-HRM分析[0042]1小鼠细小病毒DNA的提取：[0043]采用天根DNA提取试剂盒提取样品中的小鼠细小病毒DNA，样品组织可以是组织脏器、粪便或细胞培养物。[0044]2阳性标准样品的制备：[0045]为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品，为之后的临床样品检测提供HRM阳性对照，本发明需优先制备小鼠细小病毒MVM株与MPV株阳性标准样品。标准样品的制备步骤如下：分别取经过测序确定为MVM株和MPV株的质粒DNA作为模板质粒浓度稀释至106c〇piesAiL，以Pl和P2为上下游引物在加有荧光饱和染料下的进行PCR扩增，其预扩增反应体系为：[0047]PCR扩增反应程序为：94°C预变性3min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸35s;循环35次;72°C终延伸5min;HRM分析仪器熔解温度设定是以每步升温0.3°C的速率从80°C到90°C进行荧光信号的收集。[0048]3阳性标准样品PCR-HRM结果分析[0049]HRM分析过程在Rotor-GeneQ分析仪进行，该仪器可以完成PCR-HRM分析全过程，也可以在普通PCR仪上完成PCR扩增再将PCR产物直接转移至Rotor-GeneQ中完成熔解分析。由于无需开盖，从而保证了PCR产物不受污染。小鼠细小病毒MVM株与MPV株标准样品HRM结果如图1、图2所不。[0050]图1为质粒标准品PCR扩增产物标准化熔解曲线图，MVM株与MPV株熔解曲线差异明显。图2为熔解曲线导数图即峰型熔解曲线，其中MVM株扩增的熔解曲线有两个峰，Tml平均值为84.75°C、Tm2平均值为86.85°C、ATmTm2-Tml平均值为2.10°C;MPV株熔解曲线为单峰型，平均Tm值为85.57°C。[0051]实施例3临床样品的PCR-HRM检测[0052]1从样本中提取病毒DNA:方法同实施例2中DNA提取方法；[0053]2以提取的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增反应体系为：[0055]PCR扩增反应程序为：94°C预变性3min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸35s;循环35次;72°C终延伸5min;HRM分析仪器熔解温度设定是以每步升温0.3°C的速率从80°C到90°C进行荧光信号的收集。[0056]3对扩增产物进行HRM分析，确定小鼠细小毒株类型[0057]本发明对28份临床样本进行检测，检测结果如图3、4。[0058]图3为PCR扩增产物标准化熔解曲线图，两种毒株PCR扩增产物熔解曲线差异明显。图4为峰型熔解曲线图。通过对图形的分析，发现其中有20份样本熔解曲线有两个熔解区间即峰型曲线有两个熔解峰的，判断为小鼠细小病毒MVM株;另外8份样本熔解曲线只有一个熔解区间即峰型曲线只有一个熔解峰的，判断为小鼠细小病毒MPV株。[0059]进一步对熔解曲线进行分析:小鼠细小病毒MVM株阳性样品熔解曲线表现为双峰型，第一个熔解峰的Tm值Tml统计为84.63±0.14°C，第二个熔解峰的Tm值Tm2统计为86·76±0·12°C，ATmTm2-Tml值为2·13±0·027°C;MPV株阳性样品熔解曲线Tm值为85·4±0.12°C。由于实际检测中熔解曲线Tm受多方面因素的影响会有些变化，包括核酸片段本身、反应试剂盐离子浓度及饱和荧光染料浓度微弱变化，故介定一个宽的Tm范围。[0060]以本发明引物和方法，在99%置信区间内，当检测样品含有2个熔解峰时，若Tml范围为84.63±0.42。：、1'1112范围为86.76±0.36。：且八1'1111'1112-1'1111值为2.13±0.08。：则判定该样品含小鼠细小病毒MVM型毒株；当检测样品只有1个熔解峰，熔解Tm值在85.4±0.36°C时，判定为小鼠细小病毒MPV型毒株。[0061]另外，对这28份样品用针对保守基因的引物进行扩增并测序，做进化分析，分析结果与本发明方法检测的结果完全一致，说明本发明方法的准确性高，可达1〇〇%。[0062]实施例4特异性试验[0063]选取小鼠易感的几种DNA病毒和细菌进行特异性检测，选取的病毒有大鼠细小病毒KRV株、鼠痕病毒ECT、小鼠腺病毒MAV、小鼠巨细胞病毒MCMV、多瘤病毒Poly、肝螺杆菌.Aepaticus和鼠伤寒沙门氏菌S.。将非小鼠细小病毒样本与阳性标准品按照相同的加样体系和PCR反应条件进行反应，分析PCR产物熔解曲线结果。[0064]特异性试验凝胶电泳图结果如图5所示。图5表明除了阳性标准品对照外，其他非小鼠细小病毒病原电泳图中未出现目的条带。非细小病毒病原的未能扩增的实验依据保证了本发明所涉及的引物的特异性，进一步也保证了本发明方法的可靠性。[0065]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：2.—种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的HRM检测试剂盒，其特征在于:该试剂盒含有权利要求1所述的引物。3.—种快速鉴别小鼠细小病毒MVM株与MPV株的的HRM检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1从样品中提取病毒核酸；2以核酸为模板，利用权利要求1所述的引物对Pl和P2以及荧光饱和染料，进行扩增反应获得扩增产物；3对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型；上述方法用于非疾病的诊断和治疗。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中扩增反应体系如下：5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，步骤2中扩增反应程序如下:94°C预变性3min;94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸35s;循环35次；72°C终延伸5min。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3中HRM分析仪器熔解温度设定是以每步升温0.3°C的速率从80°C到90°C进行荧光信号的收集。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤3中HRM分析的具体分析过程:在80-90°C熔解温度范围内，若待检测样品熔解曲线有两个熔解区间即峰型曲线有两个熔解峰时，判定该样品为小鼠细小病毒MVM株;只有一个熔解峰的判定为小鼠细小病毒MPV株。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:步骤3中HRM分析的具体分析过程:在99%的置信区间内，当检测样品含有2个熔解峰时，若2个熔解峰的Tm值分别为84.63±0.42°C、86.76±0.36°C，且二者差值的绝对值为2.13±0.08°C，则判定该样品为小鼠细小病毒MVM型毒株；当检测样品只有1个熔解峰，熔解Tm值为85.4±0.36°C时，则判定为小鼠细小病毒MPV型毒株。

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