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申请/专利权人：江苏省农业科学院;扬州大学

摘要：本发明涉及一种鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记方法，属于生物工程技术领域。设计合成一对正、反引物，对不同水稻植株DNA进行扩增，如果能够扩增出117bp的特征条带即为含正常抽穗基因qHD7.4的纯合体；扩增出109bp的特征条带即为早抽穗基因qhd7.4的纯合体；如果同时存在117bp和109bp的两条特征条带，则为qHD7.4和qhd7.4的杂合体。本发明不仅能快速、准确地鉴定水稻种质资源或其育种群体中是否含有水稻正常抽穗基因qHD7.4或早抽穗基因qhd7.4，同时能进一步区分qHD7.4的纯合体和杂合体，预测后代基因型，大大提高对水稻抽穗期的选择效率，加速育种进程。

主权项：一种鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记引物,其特征在于，qHD7.4抽穗期基因特异性引物FM7‑1包括:正向引物FM7‑1‑F序列为5'‑ATGACATGGGTTCCACTACAA‑3'反向引物FM7‑1‑R序列为5'‑GTGCAGGATGAAATGCTGAT‑3'。

全文数据：一种鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记方法一、技术领域[0001]本发明涉及一种鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记方法，属于生物技术工程领域，专用于含qHD7.4基因型水稻种质资源鉴定以及新品种选育。二、背景技术[0002]水稻是我国最重要的粮食作物，全国有一半以上的人口以稻米为主食。随着我国人口的不断增加和耕地面积的相对减少，提高水稻产量成为保障我国粮食安全最重要的手段。抽穗期是水稻重要农艺性状之一，抽穗期通过决定营养生长期的长短，影响光合生产和物质积累，最终直接或间接地影响水稻的产量。近年来，不同研究者在水稻抽穗期控制基因的发掘、定位、克隆、分子机制研究，特别是QTL定位和克隆研究方面取得了重大进展SunCQ，etal.ProteinCell，2014,512:889-898。水稻抽穗期遗传机制复杂，受主效基因和微效多基因共同控制，遗传方式既有数量性状遗传特点也有质量性状遗传特性，不同类型品种会表现出不同的遗传特性，同一品种的抽穗期也会由于不同光温条件的影响而表现出差异胡时开，中国水稻科学，2012,263:373-382。[0003]水稻新品种推广过程中，许多高产优质品种由于其感光性、感温性、基本营养生长性的限制，只能在少部分区域进行种植。因此，可以通过研究影响抽穗期的不同基因功能，结合分子手段来改变品种的抽穗期，从而使水稻品种具有更广泛的适宜种植区域。截至目前，国内外的不同的研究者利用F2JC^DHs和RILs等群体定位了618个水稻抽穗期相关的基因（QTL位点，分布在水稻的全部12条染色体上http:www.gramene.org，其中至少有40多个抽穗期相关基因（QTL被克隆。三、发明内容[0004]技术问题：[0005]针对水稻抽穗期在改良选育过程中呈连续分布且易受环境因素影响造成鉴定不准确难题，本发明旨在提供分子标记方法能有效用于水稻抽穗期改良的辅助育种，大大提高育种工作的预见性。[0006]技术方案：[0007]一种鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记引物，其特征在于，qHD7.4抽穗期基因特异性引物FM7-1包括：[0008]正向引物FM7-1-F序列为5，-ATGACATGGGTTCCACTACAA-3’[0009]反向引物FM7-1-R序列为5，-GTGCAGGATGAAATGCTGAT-3，。[0010]所述引物用于鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记方法，其特征在于，用所述的qHD7.4抽穗期基因特异性引物FM7-1扩增水稻植株的基因组DNA，如果能够扩增出117bp的特征条带即为含正常抽穗基因qHD7.4的纯合体;扩增出109bp的特征条带即为早抽穗基因qhd7.4的纯合体;如果同时存在117bp和109bp的两条特征条带，则为qHD7.4和qhd7.4的杂合体。[0011]所述分子标记的扩增的20yLPCR反应体系包括：10XPCRBufferMg2+2.0mL，lOmmolLdNTP0.5yL，5UyLTaq酶0.2yL，10pmolL正向引物FM7-1-F1.0yL，10pmolL反向引物FM7-1-R1.0yL，DNA2.0yL，ddH2013.3yL。[0012]PCR反应条件包括:94°C预变性5min，然后94°C变性lmin、51°C退火lmin、72°C延伸1.5min，32个循环，最后72°C延伸IOmin，10°C冷却IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。[0013]有益效果[0014]本发明提供的一种鉴别水稻抽穗期基因的分子标记方法，具有以下优点：[0015]1本发明针对水稻抽穗期在改良选育过程中呈连续分布且易受环境因素影响造成鉴定不准确的技术难题，通过对构建的广陆矮4号为受体，日本晴为供体的染色体单片段代换系进行研究，定位了1个影响水稻抽穗期的主效QTLqHD7.4，近等基因系NIL将日本晴中qHD7.4等位基因导入到广陆矮4号在长日照条件下比广陆矮4号推迟12.8天抽穗期。进一步克隆了qHD7.4并对其功能研究发现，广陆矮4号中的qhd7.4等位基因由于在PRR基因第7外显子存在一个Sbp缺失（图1，缺失导致氨基酸移码产生一个终止密码子，造成广陆矮4号等位基因qhd7.4翻译编码提前终止，功能缺失后的qHD7.4基因（即早抽穗基因qhd7.4导致抽穗期提前。在qHD7.4基因克隆的基础上，进一步设计得到与目标基因共分离的PCR分子标记来快捷、准确鉴定正常抽穗基因qHD7.4基因和早抽穗基因qhd7.4的不同基因型，将有利于水稻抽穗期的改良，从而提高水稻品种的适应性。[0016]2本发明提供的分子标记是根据基因的功能区域差异设计的基于PCR扩增的功能性标记，其基因型能直接反映植株的表型，不仅不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定，而且在操作上准确、高效、快捷。[0017]3本发明提供的分子标记方法能实现对水稻基因资源的快速鉴定，能从大量水稻资源中准确筛选出含有早抽穗期基因型qhd7.4的品种，这些具有早抽穗期的水稻品种在育种中可以作为优异亲本来应用于水稻抽穗期改良育种中。[0018]4本发明提供的分子标记方法能有效用于水稻抽穗期改良的辅助育种。可以有效地对分离群体中抽穗期基因qHD7.4进行基因型选择，并且能够区分杂合基因型和纯合基因型，大大提高育种工作的预见性。四、附图说明[0019]图1抽穗期基因qHD7.4分子标记的设计策略[0020]黑框部分表示引物所在位置，虚线部分表示Sbp碱基缺失位点）[0021]图23对功能标记的梯度PCR扩增结果[0022]M:DL2000，1-12泳道退火温度依次为50°C、50·2°C、50·8°C、51·7°C、52·8°C、54·1Γ、55·4Γ、56·7Γ、57·9Γ、58·8Γ、59·5Γ、59·9Γ[0023]图33对功能标记在日本晴和广陆矮4号间扩增带型[0024]图4FM7-1对籼稻品种的检测结果[0025]M:DL2000;l-30:广陆矮4号；日本晴；南京1号；南京7号;南京14号；南京15号；南京16号;华丰B;II-32B;粵泰B;苏农3037;扬稻6号；明恢78;IRBB21;多恢1号;盐恢559;镇恢084;蜀恢527;BG90-2;圭630;明恢63;绵恢725;乐恢188;粵晶丝苗；绵恢501;浙恢7954;广恢128;辐恢718;内香恢1号；宁恢906五、具体实施方式[0026]为充分公开本发明一种鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记方法，以下结合方法验证和实施实例加以说明。其具体实施步骤如下：[0027]一试验材料[0028]均为水稻生产推广品种广陆矮4号（广东）；日本晴（日本）；南京1号江苏）；南京7号江苏）；南京14号江苏）；南京15号江苏）；南京16号江苏）；华丰B广东）；II-32B湖南）；粵泰B广东）；苏农3037江苏）；扬稻6号（广东）；明恢78福建）；IRBB21菲律宾）；多恢1号泗川）；盐恢559江苏）；镇恢084江苏）；蜀恢527四川）；BG90-2斯里兰卡）；圭630圭亚那）；明恢63福建）；绵恢725四川）；乐恢188四川）；粵晶丝苗广东）；绵恢501四川）；浙恢7954浙江）；广恢128广东）；福恢718四川）；内香恢1号泗川）；宁恢906江苏）。[0029]以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为：[0030]1江银虎，早籼“广陆矮四号”品种简介，上海农业科技，1974,2:18;[0031]2蒋云洪，日本晴水稻高产栽培技术，山东农业科学，1981，2:28-29;[0032]3林世成，等.中国水稻品种及其系谱.上海:上海科学技术出版社.1991:57南京1号江苏）；南京7号江苏）；[0033]4查元渊等，中籼稻新品种-南京14号，江苏农业科学，1989，7:16-17;[0034]5仲维功等，中籼南京15号的选育及其主要特征特性，江苏农业科学，1998,4:10-11;[0035]6仲维功能等，优质高产抗病籼稻新品种-南京16号，江苏省农业科学，2000，5:16-17；[0036]7吴传根等，新质源不育系Π-32A的开发利用研究，杂交水稻，1992，3:24-25;[0037]8周杰等，籼稻粵泰B成熟胚愈伤组织诱导培养条件初探，湖北农业科学，2007，4711：1224-1227；[0038]9潘学彪，优质丰产抗病中籼稻新品种-苏农3037，江苏农业院学报，11:80;[0039]10徐卯林等，优质高产抗病中籼新品种扬稻6号的选育及利用，中国稻米，2001，1:24-26;郑家团，恢复系“明恢78”的选育及其特征特性的研究，福建农业科技，1995，2:2-3；[0040]11曾列先，等，IRBB21Xa21对广东稻白叶枯病菌5个小种的抗性反应，植物保护学报，2002，292:97-100;[0041]12郭福泰等，特优多系1号，杂交水稻，1998,13⑷：32;[0042]13立生等，广谱性恢复系盐恢559及其系列杂交稻组合选育，江苏农业学报，2009,253：469-473；[0043]14盛生兰等，籼稻恢复系镇恢084的选育及利用，杂交水稻，2002,17⑵：6-7;[0044]15王玉平等，高配合力优质水稻恢复系蜀恢527的选育与利用，杂交水稻，2004，19⑷：12-14;[0045]16李育红等，水稻骨干亲本BG90-2在扬稻系列培育中的作用及对白叶枯病抗性，2011，25⑷：439-442;[0046]17王德师，圭630及其配组的杂交水稻品种，福建农业科技，1979,357-59;[0047]18吴方喜等，籼型杂交稻恢复系明恢63的利用与创新，福建农业科学，2011，266：1101-1112；[0048]19黄廷友等，绵恢725及其相关亲本的ISSR分析，西南科技大学学报，2008，231：87-90；[0049]20李乾安等，高产稳产杂交水稻新组合蓉18优188，杂交水稻，2013，283:77-78;[0050]21何秀英等，特优质抗病水稻新品种粵晶丝苗的选育，广东农业科学，2007，8:7-8；[0051]22谢崇华等，水稻恢复系绵恢501的选育及系列组合的应用，杂交水稻，1997,123：8-10；[0052]23黄益峰等，浙恢7954实现高产制种的关键技术，浙江农业科学，2009，2:339-340；[0053]24郭国强等，广恢128与不同类型不育系测配？:代表现研究，广西农业科学，2004,35⑷：279-281;[0054]25霍二伟等，高产抗病杂交水稻新组合双辐优718，杂交水稻，2011，265:88-89〇[0055]二鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记的获得[0056]1分子标记的开发[0057]1水稻抽穗期基因qHD7.4等位基因的核苷酸序列分析[0058]根据本实验室多年来研究结果，针对水稻抽穗期在改良选育过程中呈连续分布且易受环境因素影响造成鉴定不准确的技术难题，通过对构建的广陆矮4号为受体，日本晴为供体的染色体单片段代换系进行研究，定位了1个影响水稻抽穗期的主效QTLqHD7.4，将日本晴中qHD7.4等位基因导入到广陆矮4号的近等基因系NIL在长日照条件下比广陆矮4号推迟12.8天抽穗期，含有抽穗期基因qHD7.4的染色体单片段代换系C32125见王军等，中国水稻科学，2016,303:247-255与受体亲本广陆矮4号相比，仅在第7染色体末端导入0.33Mb的日本晴片段，因此将C32125定义为qHD7.4的近等基因系NIL。进一步克隆了qHD7.4并对其功能研究发现，广陆矮4号中的qhd7.4基因由于在PRR基因第7外显子存在一个8bp缺失（图1，缺失导致氨基酸移码产生一个终止密码子，造成广陆矮4号等位基因qhd7.4翻译编码提前终止，功能缺失后的qHD7.4基因（S卩qhd7.4基因）导致抽穗期提前。[0059]2引物设计[0060]根据qHD7.4与其等位基因在核苷酸序列上存在的差异，利用PrimerPremier5.0在Sbp缺失区域的两侧设计包含该缺失位点的基因功能标记，本研究所合成引物见表1。引物由Invitrogen中国公司合成。[0061]表IqHD7.4功能标记序列[0062][0063]2分子标记的验证[0064]1水稻植物基因组DNA提取[0065]水稻植株基因组DNA的提取参照SDS法（DellaportaSL，etal.，PlantMolBiolRep，1983，II:19221.。具体步骤为:取水稻分蘖期叶片1克左右，在-20°C预冷的研钵中用液氮研磨并装入2.OmL离心管；加入600uL提取液（20%SDS，IMTris-HCl，0.5MEDTA，5MNaCl，65°C预热），摇匀，65°C温浴30min，中间振荡3〜4次；加入14体积5MKAC，摇匀后置冰上30min;加入氯仿-异戊醇（24:1300〜400uL，在摇床上充分振荡，120rpm，30min;8，000〜10,OOOrpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清400uL左右至另一离心管;加入等体积氯仿-异戊醇24:1，摇床上充分振荡，80〜90rpm，30min;8,OOOrpm离心15分钟，转移上清400uL左右）至新的离心管；加入2倍体积-20°C预冷的无水乙醇，轻轻摇匀直到有絮状物产生，12，OOOrpm离心6min;弃无水乙醇，加入4°C70%乙醇，放置lOmin，弃上清，超净工作台上风干Ih;加入100〜200uLTE，-20°C保存。[0066]⑵分子标记的扩增和电泳检测[0067]20yLPCR反应体系包括：10XPCRBufferMg2+2.OmUdNTP10mmolL0.5yL，Taq酶（5UyL0·2yL，正向引物（IOpmo1LI·OyL，反向引物（IOpmo1LI·OyL，DNA2·OyL，ddH2013.3yL〇[0068]PCR反应条件包括:94°C预变性5min，然后94°C变性lmin、51°C退火lmin、72°C延伸1.5min，32个循环，最后72°C延伸IOmin，10°C冷却IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。[0069]反应结束后扩增产物加入指示剂0.25%溴酚兰、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液），将扩增产物在3.5%琼脂糖和10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，琼脂糖凝胶电泳后经DuRed染色，紫外凝胶成相系统保存图像，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后硝酸银染色，拍照保存图像。[0070]3分子标记的筛选和验证[0071]以SDS方法提取的日本晴DNA为模板，利用表1设计的引物进行梯度PCR筛选，温度梯度为50〜60°C，扩增产物在1.5%琼脂糖电泳分析（图2。由图2可以看发现这3对引物在退火温度为50和51°C都能够扩增出单一的目的条带。[0072]利用这3对标记对广陆矮4号GLA4和日本晴Nip进行PCR扩增，PCR产物在3.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果发现这3对标记均能扩增出单一的目的条带，但在琼脂糖凝胶电泳下3对标记都很难区分日本晴和广陆矮4号间存在的片段差异（图3A。进一步利用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶对3对标记扩增的PCR产物进行电泳，硝酸银染色。结果表明：在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下3对功能标记都准确的区分日本晴和广陆矮4号在qHD7.4上存在的片段差异（图3B。[0073]⑷对水稻资源的qHD7.4基因型鉴定[0074]利用qHD7.4功能标记FM7-1对江苏省近年来生产上主推的粳稻品种、部分籼稻品种和恢复系、太湖流域地方粳稻资源进行进行PCR扩增，扩增产物在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色（图4。结果表明：28份籼稻材料中只有南京1号、南京7号、华B、扬稻6号、多恢1号和BG90-2含有纯合的早抽穗基因qhd7.4基因型，其余22份籼稻材料均为纯合的正常抽穗基因qHD7.4基因型。65份江苏省主推常规粳稻品种和179份太湖流域地方粳稻资源都是含有纯合的qHD7.4基因型。说明qHD7.4基因功能缺失的早抽穗基因qhd7.4基因型类型只分布在少部分籼稻资源中，粳稻资源中均为qHD7.4功能正常的品种。[0075]表2籼稻品种qHd7.4基因型分析[0076][0077]qHD7.4基因：[0078]

权利要求：1.一种鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记引物，其特征在于，qHD7.4抽穗期基因特异性引物FM7-1包括：正向引物FM7-1-F序列为5’-ATGACATGGGTTCCACTACAA-3’反向引物FM7-1-R序列为5’-GTGCAGGATGAAATGCTGAT-3’。2.权利要求1所述引物用于鉴别水稻抽穗期基因qHD7.4的分子标记方法。3.根据权利要求2所述的分子标记方法，其特征在于，用权利要求1所述的qHD7.4抽穗期基因特异性引物FM7-1扩增水稻植株的基因组DNA，如果能够扩增出117bp的特征条带即为含正常抽穗基因qHD7.4的纯合体;扩增出109bp的特征条带即为早抽穗基因qhd7.4的纯合体;如果同时存在117bp和109bp的两条特征条带，则为qHD7.4和qhd7.4的杂合体。4.根据权利要求2或3所述的分子标记方法，其特征在于，所述分子标记的扩增的20yLPCR反应体系包括：10XPCRBufferMg2+2.0mL，10mmolLdNTP0.5yL，5UyLTaq酶0·2μL，IOpmoIL正向引物FM7-1-FI·OyL，IOpmoIL反向引物FM7-1-RI·OyL，DNA2·OyL，CldH2O13.3yL〇5.根据权利要求2或3所述的分子标记方法，其特征在于，所述分子标记扩增的PCR反应条件包括:94°C预变性5min，然后94°C变性lmin、51°C退火lmin、72°C延伸1.5min，32个循环，最后72°C延伸10min，10°C冷却IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。

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