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龙图腾网恭喜华南农业大学申请的专利检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂、试剂盒及其应用获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN116068177B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-02-18发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202310034659.8，技术领域涉及：G01N33/569；该发明授权检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂、试剂盒及其应用是由肖立华;孙连静;冯耀宇;李娜;郭亚琼设计研发完成，并于2023-01-10向国家知识产权局提交的专利申请。

本检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂、试剂盒及其应用在说明书摘要公布了：本发明公开了一种检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂、试剂盒及其应用，属于生物技术领域。本发明通过利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体；用荧光染料标记步骤S1所得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体，即获得检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂。应用本发明试剂建立的直接免疫荧光检测方法，可用于临床粪便样本及环境中微小隐孢子虫的检测及鉴定，且敏感性高、特异性强、稳定性好、诊断速度快，具有良好的应用前景。

本发明授权检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光试剂、试剂盒及其应用在权利要求书中公布了：1.一种检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、利用微小隐孢子虫全虫蛋白作为抗原，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体；S2、用荧光染料标记步骤S1所得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体，即获得检测微小隐孢子虫的直接免疫荧光检测试剂；所述的步骤S1中，微小隐孢子虫全虫蛋白通过如下方法获得：取微小隐孢子虫卵囊，4℃条件下，13200rmin离心3min，次氯酸钠溶液冰上处理10min，离心并去除次氯酸钠溶液，加入蛋白酶抑制剂和PBS后进行冰上超声破碎处理，而后于液氮中反复冻融后得到微小隐孢子虫全虫蛋白溶液；所述的次氯酸钠溶液的浓度为1.3wt%；所述的蛋白酶抑制剂和PBS的体积比为1：200；所述的步骤S1中，抗微小隐孢子虫的单克隆抗体的亚类为IgG1，仅与微小隐孢子虫的卵囊壁反应；采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体的具体步骤为：（1）取微小隐孢子虫全虫蛋白与等体积佐剂混合，乳化后对小鼠进行背部皮下多点注射免疫，首免后第14、28、35天分别进行二至四免；四免后第7天断尾采血分离血清，通过间接ELISA方法检测血清的抗体效价，在血清抗体效价达到十万后，用不加佐剂的全虫蛋白溶液腹腔冲击免疫小鼠，3天后进行融合；（2）细胞融合：将小鼠脾细胞与SP20骨髓瘤细胞按5：1的比例置于融合瓶中，离心后弃上清，重悬细胞沉淀后沿管壁加入预热的50％PEG融合剂，缓慢加入无血清DMEM培养基终止融合，静置后离心；使用HAT培养基悬浮细胞沉淀，混合后加入含有饲养细胞的细胞培养板，置于恒温CO2培养箱中培养；（3）杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆：使用间接ELISA法及间接免疫荧光法同时筛选目的阳性融合细胞，并进行两轮亚克隆，获得能稳定分泌针对微小隐孢子虫卵囊壁的杂交瘤细胞株；其中使用间接ELISA法检测时采用微小隐孢子虫全虫蛋白作为检测抗原，使用间接免疫荧光法检测时采用微小隐孢子虫作为检测抗原；（4）单克隆抗体制备：选择经产雌性BALBc小鼠腹腔注射降植烷，7天后腹腔内注射杂交瘤细胞，待小鼠腹腔明显隆起时收集小鼠腹水，采集的小鼠腹水经离心后取上清液保存，经纯化后即获得抗微小隐孢子虫的单克隆抗体。

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