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摘要：本发明提供一种大肠杆菌利用甲醇和D‑木糖发酵生产D‑阿洛酮糖的方法，利用大肠杆菌为宿主细胞，通过在野生大肠杆菌中表达外源基因甲醇脱氢酶Mdh、3‑己糖‑6‑磷酸合成酶Hps、6‑磷酸‑3‑己糖异构酶Phi、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸差向异构酶AlsE、D‑阿洛酮糖‑6‑磷酸磷酸酶A6PP，建立一条从甲醇和D‑木糖到合成D‑阿洛酮糖的路径。为提高AlsE蛋白的表达量引入蛋白标签SUMO。通过敲除副产物途径基因frmABR，磷酸戊糖途径的关键基因rpiA，以及糖酵解途径的关键基因pfkA，pfkB，得到一株重组菌株，实现碳源的理性控制，从而实现大肠杆菌利用甲醇和D‑木糖高效合成D‑阿洛酮糖。

主权项：1.一种大肠杆菌利用甲醇和D-木糖发酵生产D-阿洛酮糖的方法，其特征在于，通过引入外源基因mdh、hps、phi、alsE、a6PP，建立以甲醇和D-木糖为碳源制备D-阿洛酮糖的合成路径，通过敲除副产物途径基因frmABR、磷酸戊糖途径的关键基因rpiA、以及糖酵解途径的关键基因pfkA、pfkB，最终得到D-阿洛酮糖高效合成的重组菌株；所述的大肠杆菌利用甲醇和D-木糖发酵生产D-阿洛酮糖的方法，具体包括以下步骤：1）通过构建重组载体，在野生型大肠杆菌JM109DE3中表达外源蛋白Mdh、Hps、Phi、AlsE、A6PP，得到重组菌株E.coli-MdhHpsPhiAlsEA6PP，建立以甲醇和D-木糖为碳源合成D-阿洛酮糖的细胞工厂；2）利用SUMO标签，融合表达AlsE-SUMO蛋白，增强AlsE蛋白在大肠杆菌中的表达量，在野生型大肠杆菌中分别表达外源蛋白AlsE、A6PP和外源蛋白AlsE-SUMO、A6PP，得到重组菌株E.coli-AlsEA6PP和重组菌株E.coli-SUMO-AlsEA6PP；进一步借助胞外酶催化实验，确定添加SUMO标签对AlsE蛋白在大肠杆菌中高效表达的有效作用；3）敲除副产物途径基因frmABR、磷酸戊糖途径的关键基因rpiA以及糖酵解途径的关键基因pfkA、pfkB，得到重组菌株E.coli-MdhHpsPhiAlsEA6PPΔFrmABRΔRpiAΔPfkAΔPfkB，进而实现D-阿洛酮糖的高效合成；其中，frmABR的GeneID为944988、944991、944986，rpiA的GeneID为947407，pfkA的GeneID为948412，pfkB的GeneID为946230；步骤1）中在大肠杆菌JM109DE3中表达的外源基因mdh、hps、phi，其中mdh基因来自钩虫菌，hps基因来自甲醇芽孢杆菌，phi基因来自荚膜甲基球菌，基因序列参照NCBI数据库，mdh、hps、phi基因的NCBI序列号分别为WP_013953014.1、WP_014707664、WP_064496767，alsE基因来自大肠杆菌K-12菌株，a6PP基因来自脆弱拟杆菌，基因序列参照NCBI数据库，alsE和a6PP基因的NCBI序列号分别为S101520_02794和BF9343_0892。

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