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摘要：本发明提供文库制备方法、试剂盒及测序方法。所称的文库制备方法包括获取目标核酸分子，包括：对源自待测核酸样本的RNA进行逆转录，获得逆转录产物，逆转录产物包括RNA:DNA杂合双链，及富集逆转录产物中的RNA:DNA杂合双链；提供转座复合体，该转座复合体包含接头和转座酶，接头为序列已知的双链核酸分子；使目标核酸分子和转座复合体置于适于转座反应的条件下接触，获得转座产物，该转座产物包含末端带有接头且包含缺口的双链核酸分子；提供第一引物，第一引物配置为能与所述接头的至少一部分杂交；以及使转座产物与第一引物杂交并置于适于链置换反应的条件下，以获得文库。该方法特别适于低起始量的RNA文库的快速构建。

主权项：1.一种测序方法，其特征在于，包括：制备文库，包括：获取目标核酸分子，包括：利用混合引物对源自待测核酸样本的RNA进行逆转录，获得逆转录产物，所述逆转录产物包括RNA:DNA杂合双链，所述混合引物包括OligodT和随机引物，所述OligodT和所述随机引物在逆转录反应体系中的比例为1:2~1:6，以及富集所述逆转录产物中的RNA:DNA杂合双链，获得所述目标核酸分子；提供转座复合体，所述转座复合体包含接头和转座酶，所述接头为序列已知的双链核酸分子，所述转座酶为Tn5转座酶或其工具酶；使所述目标核酸分子和所述转座复合体置于适于转座反应的条件下接触，获得转座产物，所述转座产物包含末端带有接头且包含缺口的双链核酸分子；提供第一引物，所述第一引物配置为能与所述接头的至少一部分杂交；以及使所述转座产物与所述第一引物杂交并置于适于链置换反应的条件下，以获得所述文库；对文库进行测序，获得测序结果，所述测序结果包括第一测序数据和第二测序数据，对所述文库进行测序，获得所述测序结果，包括：（1）加入测序引物，对测序模板进行第一测序，以便通过形成第一新生链获得所述第一测序数据，所述测序引物配置为与所述测序模板的3'末端杂交；（2）去除所述第一新生链；（3）加入所述测序引物，对所述测序模板进行第二测序，以便通过形成第二新生链获得所述第二测序数据，构建矫正模型，对所述第一测序数据和所述第二测序进行校正，其中，构建矫正模型包括：1使用python语言，提取所述第一测序数据和所述第二测序数据同一坐标两次测序读长均≥25bp的Reads，分别输出为T1和T2两个文件；2将T1和T2中位置对应的Reads相互间做排列，在排列结果中标记两条Reads一致和不一致的Base，得到CommonReads；3分别将文件T1和T2和Reference做配对，得到Sam1和Sam2文件，将Sam1和Sam2中位置对应且配对到同一位置的Reads，找到Reference中最长公共子串RefReads，所述公共子串指两条对应的Readsmapping后均覆盖的区域；4比较2中的CommonReads和3中的RefReads，对于CommonReads中不一致的Base，标记其是否真实存在于Reference中，若存在，对于没有测到的Reads则为Deletion；若不存在，对于测到的Reads则为Insertion；5统计4中的Deletion和Insertion情况，同时统计该不一致位置上前后Base的种类，得到在不同Base类型前或后引起Insertion或Deletion的概率。

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