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摘要：本发明提供基于KIF20A蛋白的温敏水凝胶疫苗、制备方法及应用，属于生物技术领域，本发明是基于KIF20A蛋白构建肝细胞癌疫苗，通过共递送脂质体Vac和温敏水凝胶合理地优化疫苗性能，增强其免疫激活效率，提高体内疫苗缓释效果，最后评估证实所制备的KIF20A蛋白疫苗在增强PD‑L1阻断治疗疗效方面具有良好的效果。

主权项：1.基于KIF20A蛋白的温敏水凝胶疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、共递送脂质体Vac的合成分别称取2,3-二油氧基丙基三甲基氯化铵DOTAP、胆固醇和磷脂-聚乙二醇2000DSPE-PEG2000，溶于氯仿中，超声分散均匀，取定量于圆底烧瓶中，加入R848，充分溶解后，在40℃下真空旋蒸直至溶剂完全蒸发，随后再加入氯仿，重复旋蒸步骤；待旋蒸结束后，圆底烧瓶内壁形成一层薄膜；取KIF20A蛋白水溶液，在水浴下超声1分钟水化；将所得溶液吸入脂质体挤出器中，在40℃下将脂质体分别推过200nm孔径和100nm孔径的聚碳酸酯膜；随后，将所得溶液加入纳米透析装置透析12小时；最后，将溶液洗出，加水定容，转移至玻璃瓶内，冻干，得共递送脂质体Vac；步骤二、PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物水凝胶的合成取一干净的三口圆底烧瓶，加入磁力搅拌子，随后加入PEG1500，连接油泵，抽真空后通入氮气，排除瓶内氧气残留；随后在油浴锅中加热至120℃并搅拌30分钟，使PEG1500充分融化；再次打开油泵抽真空，120℃加热2小时以彻底除去PEG1500中可能存在的水分；称取DL-丙交酯和乙交酯，转移至通风橱，向圆底烧瓶内通入氮气，迅速将称好的DL-丙交酯和乙交酯加入瓶内，塞好瓶塞；抽真空，排除瓶内水分和氧气，120℃加热30分钟，使DL-丙交酯和乙交酯溶解并在搅拌下与PEG1500充分混合；使用注射器吸取辛酸亚锡，注入圆底烧瓶内，封管，将温度上升到150℃，维持8小时；待反应降至室温后，向圆底烧瓶内加入二氯甲烷，使粗产物充分溶解，并转移至新的平底烧瓶中，加入石油醚，使沉淀析出，过滤，所得固体重新溶于二氯甲烷中，加入石油醚析出沉淀并抽滤，得到高纯度的PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物，所得固体在真空环境干燥24小时至恒重，保存待用；步骤三、KIF20A温敏水凝胶疫苗CSF-VacGel的制备将共递送脂质体Vac负载到温敏水凝胶中，制备成温敏水凝胶疫苗CSF-VacGel，具体步骤如下：①将步骤二所得PLGA-PEG-PLGA三嵌段共聚物溶于超纯水，4℃下搅拌24小时，再加入小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF，得到CSFGel，4℃保存待用；②向CSFGel中加入步骤一所得共递送脂质体Vac粉末，涡旋使其分散均匀，得到KIF20A温敏水凝胶疫苗CSF-VacGel。

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