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摘要：本发明是一种基于CRISPRCas12a和逻辑门的甲流和乙流信号分析系统。本发明将CRISPRCas12a系统与SDA等温扩增和逻辑门耦联，成功实现了甲流和乙流病毒的逻辑识别。BstNI精确切割可以实现病毒RNA的转化，拓宽了靶标检测范围。SDA等温核酸扩增可提供高效的扩增，无需复杂的温度循环设备，可实现靶标信号的放大。CRISPRCas12a具有高度特异性识别能力，可以增强对靶标的识别，其模块化特性增加了与其他分子网络衔接的能力。逻辑门实现了对甲流和乙流的逻辑信号分析。同时，我们提出的这种检测策略，只需要改变转换子和扩增的模板，就可以实现其他核酸的检测。结果表明，该逻辑门生物传感器在疾病诊断方面具有潜在的应用价值。

主权项：1.一种基于CRISPRCas12a和逻辑门的甲流和乙流信号分析系统，其制备方法包括以下步骤：1甲流和乙流RNA序列转化初始阶段涉及BstNI精确切割RNADNA异源双链体中的DNA，以将甲流或乙流RNA转化为短DNA；将8ul的甲型乙型流感病毒RNA、8ul10uM的甲型乙型流感病毒DNA转化子于37摄氏度孵育10分钟；接着加入1.5ul10×的NEBuffer3.1、1.7ul10Uul的BstNI和0.8ul的焦碳酸二乙酯DEPC处理水在55摄氏度反应10分钟，即可得到转化的启动子AB；将以上转化的启动子AB置于4摄氏度储存；2输入链的制备利用制备的启动子用于链置换等温扩增SDA产生下游逻辑门的输入链；将10ul的转化产物、1ul10uM的模板AB、1ul10×的BstDNAPolymerase、1ul10×的ThermoPol、1ul10×的Nt.BstNBI、1ul10×的NEBufferr3.1、1ul10mM的dNTP和4ul的纯净水混合，在55摄氏度反应30分钟后在80摄氏度反应15min终止反应，即可得到输入链InputAB；3逻辑门的制备1.2ul10uM的crRNA、1ul10uM的Cas和22.8的DEPC水混合制备400n的crRNA-Cas复合物；AND逻辑门门控体系中包含2ul400nM的crRNA-Cas复合物、2ul10×的Cutsmart缓冲液、1ul5uM的HEX报告基因、2ul10mM的DTT溶液和3ul的DEPC水；400nM的crRNA-Cas复合物、1uM的OR-pre-exsited-R以体积比2：1孵育10min制备预复合物1；400nM的crRNA-Cas复合物、1uM的OR-pre-exsited-L以体积比2：1孵育10min制备预复合物2；OR逻辑门门控体系中包含1ul预复合物1、1ul预复合物2、2ul10×的Cutsmart缓冲液、1ul5uM的HEX报告基因、2ul10mM的DTT溶液和3ul的DEPC水；800nM的crRNA-Cas复合物、1uM的NOR-pre-exsited-L1、1uM的NOR-pre-exsited-R1以体积比2：1：1孵育10min制备预复合物3；800nM的crRNA-Cas复合物、1uM的NOR-pre-exsited-L2、1uM的NOR-pre-exsited-R2以体积比2：1：1孵育10min制备预复合物4；NOR逻辑门门控体系中包含1ul预复合物3、1ul预复合物4、2ul10×的Cutsmart缓冲液、1ul5uM的HEX报告基因、2ul10mM的DTT溶液和3ul的DEPC水；这样就建立起基于逻辑门的甲流和乙流信号分析系统；4信号输出将10ul的InputAB与制备好的10ul的AND、OR、NOR逻辑门门控体系溶液混合，于ROTOR荧光仪在37摄氏度反应1小时，在HEX通道测荧光信号，即可对甲流和乙流进行逻辑信号分析。

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百度查询： 重庆医科大学国际体外诊断研究院 基于CRISPR/Cas12a和逻辑门的甲流和乙流信号分析系统