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摘要：本发明公开一种基于细胞爬片的荧光原位杂交方法，旨在提供一种更为简便、经济且高效的实验手段，用于探究寡核苷酸在细胞中的定位；该方法通过优化实验步骤和条件，实现了在无需特殊杂交盒设备和其他复杂耗材的情况下，利用简单设备即可完成荧光原位杂交反应；具体步骤包括细胞接种、洗涤、固定、通透、预杂交、杂交、洗涤与封闭、抗体孵育、洗涤与封片以及观察与分析；该方法不仅降低了实验成本，还简化了操作步骤，提高了实验效率；通过荧光显微镜观察，能够清晰地看到寡核苷酸在细胞中的定位情况，为相关领域的研究提供了有力的技术支持。本发明的实施例验证了该方法的可行性和准确性，具有广泛的应用前景。

主权项：1.一种基于细胞爬片的荧光原位杂交方法，其特征在于，包括以下具体步骤：步骤S1：细胞接种：提前将细胞接种在已经铺有圆形玻片的12孔细胞板中；对于原代细胞，提前一天进行细胞分选，然后接种于12孔细胞板中；步骤S2：洗涤：次日，弃除细胞培养基，用0.1％PBST缓慢洗涤3次，每次5分钟，以去除细胞表面的杂质和残留物；步骤S3：固定：加入4％PFA固定30分钟，然后弃除4％PFA，再用0.1％PBST洗涤3次，每次5分钟，以固定细胞形态；步骤S4：通透：加入0.3％TritonX-100通透20分钟，然后弃除0.3％TritonX-100，再用0.1％PBST洗涤3次，每次5分钟，以使探针能够顺利进入细胞内；步骤S5：预杂交：加入HYB-，在55℃下静置孵育5分钟，以去除细胞内的非特异性结合位点；步骤S6：杂交：弃除HYB-，加入HYB+，在55℃下静置孵育3小时，然后加入HYB+配制的探针，在55℃下静置孵育过夜，使探针与细胞内的目标序列特异性结合；步骤S7：洗涤与封闭次日，回收探针，加入50％乙酰胺-2×SSCT，在55℃下静置孵育30分钟，重复一次；再用2×SSCT在55℃下静置孵育15分钟；加入0.2×SSCT，在55℃下静置孵育30分钟，重复一次；封闭：加入2％羊血清，室温封闭15分钟，以封闭非特异性结合位点；步骤S8：抗体孵育一抗孵育：加入2％羊血清配制的一抗，在4℃摇床上以26rpm的速度孵育过夜；次日，提前将样本取出，平衡复温10分钟；回收一抗：回收一抗后，用0.1％PBST洗涤3次，每次10分钟；二抗孵育：将相应宿主来源的荧光二抗原液、DAPI和2％羊血清按照说明书要求比例进行稀释，混匀后加入样本孔中，室温避光摇床上以26rpm的速度孵育2小时；步骤S9：洗涤与封片：回收二抗后，用0.1％PBST洗涤3次，每次10分钟；加入防淬灭剂进行封片，以保护样本并防止荧光淬灭；步骤S10：观察与分析：在荧光显微镜下进行不同倍数的观察，并进行图像采集和分析，以确定寡核苷酸在细胞中的定位。

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