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摘要：本发明属于土壤修复技术领域，具体涉及一种修复铅镉污染土壤的微生物复合剂及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：1、无机载体的制备，以电解锰渣、膨润土、苏打粉为原料组分；2、微生物菌菌液的制备，基于铅镉污染土壤，通过富集、分离、驯化、筛选等步骤得到；3、微生物复合剂的制备，由无机载体负载微生物菌得到。本发明的微生物复合剂中无机载体无毒无害、稳定性强、孔隙率高且不易开裂，与微生物菌契合度较高，便于营养物质的富集和微生物的固定，并且固定微生物的密度高，可进行标准化制作生产。并且，便于回收，不产生二次污染，能够广泛应用于重金属污染土壤治理领域。

主权项：1.一种修复铅镉污染土壤的微生物复合剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、无机载体的制备按照质量比4:3:3依次称取电解锰渣、膨润土、苏打粉，置于研钵中研磨，混合均匀后，分5次喷洒蒸馏水；蒸馏水喷洒完毕后手工造粒，所得颗粒粒径为3-4mm；随后，将所得颗粒置于恒温培养箱中陈化，再转移至马弗炉焙烧；自然冷却后取出，以蒸馏水清洗焙烧所得的颗粒，再超声清洗以剔除杂质，将经超声清洗的颗粒置于烘箱中烘干至恒重，得到无机载体；步骤2、微生物菌菌液的制备2.1在无菌操作下，按照土壤样品:超纯水的质量体积比1g:10ml称取土壤样品、超纯水，将称取的土壤样品和量取的超纯水加入到三角瓶中，然后振荡，获得土壤混合液；所述土壤样品中Pb2+浓度为25mgkg、Cd2+浓度为0.56mgkg；2.2将三角瓶放至超净台静置，静置后的上清液作为铅镉钝化微生物的来源；2.3微生物菌的耐铅驯化：移取步骤2.2获得的上清液，将其接种到装有LB液体培养基的锥形瓶中，再加入铅溶液，使得体系的最终体积为100mL，其中铅浓度为50mgL；将锥形瓶封口后置入恒温摇床中，振荡培养；然后，在超净台中移取培养后获得的菌液涂布于铅浓度为50mgL的LB固体培养基平板上，平板划线后封口倒置，紫外线照射3-5min后，将倒置的平板放入恒温培养箱中培养，到此完成第一耐铅驯化周期；根据菌落的形态及显微镜检查，使用接种环从完成第一培养周期的微生物菌中挑取生长量最多的具有微透明边缘的淡黄色单菌落接种到装有LB液体培养基的锥形瓶中，再加入所述铅溶液，使得体系的最终体积为100mL，其中铅浓度为100mgL；将锥形瓶封口后置入恒温摇床中，振荡培养；然后，在超净台中，锥形瓶内取100μL培养后获得的菌液分别涂布于铅浓度为100mgL的LB固体培养基平板上，平板划线后封口倒置，紫外线照射3-5min后，将倒置的平板放入恒温培养箱中培养，到此完成第二耐铅驯化周期；上述操作过程依次类推，LB液体培养基和LB固体培养基中铅浓度依次为150、200、300、400mgL，依次完成第三、四、五、六耐铅驯化周期；2.4微生物菌的耐镉驯化：根据菌落的形态及显微镜检查，使用接种环从完成步骤2.3的第六培养周期的微生物菌中挑取生长量最多的具有微透明边缘的淡黄色单菌落接种到装有LB液体培养基的锥形瓶中，再加入镉溶液，使得体系的最终体积为100mL，其中镉浓度为50mgL；将锥形瓶封口后置入恒温摇床中，振荡培养；然后，在超净台中，移取锥形瓶中培养后获得的菌液涂布于镉浓度为50mgL的LB固体培养基平板上，平板划线后封口倒置；紫外线照射3-5min后，将倒置的平板放入恒温培养箱中培养，到此完成第一耐镉驯化周期；根据菌落的形态及显微镜检查，使用接种环从完成第一耐镉驯化周期的微生物菌中挑取生长量最多的具有微透明边缘的淡黄色单菌落接种到装有LB液体培养基的锥形瓶中，再加入镉溶液，使得体系的最终体积为100mL，其中镉浓度为100mgL；将锥形瓶封口后置入恒温摇床中，振荡培养；然后，在超净台中，移取锥形瓶中100μL培养后获得的菌液涂布于镉浓度为100mgL的LB固体培养基平板上，平板划线后封口倒置；紫外线照射3-5min后，将倒置的平板放入恒温培养箱中培养，到此完成第二耐镉驯化周期；上述操作过程依次类推，LB液体培养基和LB固体培养基中镉浓度依次为150、200、300、400mgL，依次完成第三、四、五、六耐镉驯化周期；2.5使用接种环从步骤2.4得到的完成第六耐镉驯化周期的微生物菌中挑取生长量最多的具有微透明边缘的淡黄色单菌落置于Pb2+浓度为400mgL、Cd2+浓度为400mgL的LB固体培养基平板上，平板划线后封口倒置，然后放入恒温培养箱中培养；培养完成后，使用接种环从LB固体培养基平板上挑取生长量最多的具有微透明边缘的淡黄色单菌落，将其置于100mLLB液体培养基中，后于恒温摇床中培养，得到菌液，所得菌液中微生物菌含量为2.2×108CFUmL；步骤3、微生物复合剂的制备将步骤1制得的无机载体置于锥形瓶中，加入LB液体培养基后灭菌；移取步骤2得到的菌液，将其添加入上述锥形瓶中，调节锥形瓶中pH为弱酸性，再将该锥形瓶放入恒温摇床中，振荡培养；培养完成后，采用离心机4000-6000rpm下离心3-5min；离心后去除上层液体，以PBS缓冲液清洗锥形瓶瓶底固形物3-5次，再置于干燥箱中干燥至恒重，得到微生物复合剂。

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百度查询： 中南民族大学 湖北三峡实验室 一种修复铅镉污染土壤的微生物复合剂及其制备方法