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摘要：本发明公开了一种间充质干细胞外泌体鼻炎喷雾剂的制备方法和应用，采用直径大小介于70‑170nm的膜性脂类囊泡外泌体，囊泡内含有多种具有生物活性的RNA、miRNA以及相关效应蛋白等，可有效抑制炎症的发生并促进损伤修复。本发明选用的外泌体体积微小、可装载脂质、蛋白、核酸等信号物质，便于吸收和释放且无免疫原性，并采用温敏凝胶包裹外泌体技术，保证外泌体在体外长时间具有活性。本产品使用泊洛沙姆407泊洛沙姆188甘油温敏凝胶作为载体，使外泌体可以均匀喷涂在患处，利用34±1℃成凝胶特性，作用吸附于鼻腔处，使外泌体驻留并持续缓释，这一方案解决了鼻腔上药困难，难以驻留的问题。

主权项：1.一种间充质干细胞外泌体鼻炎喷雾剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）接种：将生物反应器高压灭菌，烘干，加入无血清培养基，根据20mL片加入微载片，混合均匀；间充质干细胞复苏培养后制备浓度为1×106mL的细胞悬液，接种时细胞与微载片比例为50万片，接种密度为10mL片，补充无血清培养基至所需体积；接种当天为D0，生物反应器参数设为35rpm，5min；0rpm，2h间隙性搅拌培养，利用血糖仪监测培养基葡萄糖浓度决定补换液体积；接种24小时后为D1，测培养基葡萄糖含量，根据培养基葡萄糖浓度决定补换液体积，生物反应器参数设为50rpm匀速搅拌培养；接种后48小时为D2，取样荧光染观察细胞生长情况；测培养基葡萄糖含量，根据培养基葡萄糖浓度决定补换液体积，生物反应器参数设为50rpm匀速搅拌培养；接种后72小时为D3，取样荧光染观察细胞生长情况，如微载体长满细胞按照补充培养基量20mL片补充微载片；接种后96小时为D4，取样荧光染观察细胞生长情况，如微载体长满细胞按照补充培养基量40mL片补充微载片，生物反应器参数设为50rpm匀速搅拌培养；接种后120小时为D4，取样荧光染观察细胞生长情况，收集上清液结束培养；2）提取外泌体：将上步骤收集的上清液，采用切向流超滤系统处理，选用100kD的超滤膜包，超滤设备设置：温度4℃，操作压力2Bar，流速控制200mLmin，将上清液以100:1比例浓缩，得到浓缩液；使用低温超速离心机处理，设置温度4℃，将上述浓缩液按照300×g离心10min，2000×g离心10min，10000×g离心30min，100000×g离心70min×2次的步骤进行梯度离心，所得贴于离心管底壁淡黄沉淀物即为外泌体，用无菌PBS轻柔充分地吹打混匀至5mL，使外泌体充分重悬，保存于-80℃冰箱内；3）鉴别外泌体：使用透射电镜观察外泌体形貌，为完整圆形或类圆形结构，使用纳米颗粒跟踪分析仪分析外泌体径粒大小为70-170nm，颗粒浓度为5.0×106ParticlesmL；使用蛋白印迹技术检测外泌体表达特异性膜蛋白TSG101、CD63，不表达阴性标记物Calnexin蛋白；4）浓缩外泌体：根据BCA法蛋白定量试剂盒要求对上步骤3）鉴别后的外泌体提取液蛋白浓度进行检测，并浓缩外泌体蛋白浓度至500mgmL，得到外泌体浓缩液；5）配置泊洛沙姆温敏凝胶：按照比例，将泊洛沙姆40720gL、泊洛沙姆1885gL、甘油10gL混合后，4℃下低温搅拌，搅拌器设置500rmpmin，时间为30min，然后置于33±1℃条件下5min形成凝胶，pH为6.00-6.30，即得泊洛沙姆温敏凝胶；6）制备外泌体喷雾剂：将步骤4）得到的外泌体浓缩液、β-葡聚糖、明胶加入到步骤5）得到的泊洛沙姆温敏凝胶中，使泊洛沙姆温敏凝胶中外泌体浓缩液蛋白含量为500mgL、β-葡聚糖6gL、明胶0.1gL，再用pH调剂剂磷酸盐缓冲溶液，调节pH6-6.3，制得外泌体鼻炎温敏凝胶喷雾剂，分装至5mL喷雾瓶中，即得间充质干细胞外泌体鼻炎喷雾剂，并置于4℃保存；所述的间充质干细胞外泌体鼻炎喷雾剂，具有以下技术指标：①每1000m1所述的外泌体鼻炎喷雾剂包含：间充质干细胞外泌体500mg、泊洛沙姆40720g、泊洛沙姆1885g、甘油10g、β-葡聚糖6g、明胶0.1g、余量为去离子水；②外泌体鼻炎喷雾剂中外泌体具有很好的分散性，激光共聚焦显微镜观察显示，外泌体明亮且分散，并未出现聚集现象；③外泌体鼻炎喷雾剂具有温度敏感特性，在4℃为流动液体状，33℃±1℃为凝胶状；④所述的外泌体鼻炎喷雾剂具有很好的药物缓释效果，在2h内外泌体累积释放率为20.9%，8h内累积释放率为54.5%，24h累积释放率为76.9%。

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