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摘要：本发明涉及山兰种子萌发技术领域，且公开了一种利用脆柄菇属真菌促进山兰种子萌发的方法，选择生长在长白山区系的野生成年山兰苗根部，利用徒手切片技术及CH3COOH黑墨染色技术寻找有菌丝团的根段，将含有真菌丝团的根段在流水条件下冲洗48小时，高温灭菌后的镊子将根段夹到2％次氯酸钠溶液中浸泡30秒后，再放至于无菌水烧瓶中清洗后吸干多水份。本发明通过从山兰苗根部中寻找有菌丝团的根段，利用光照条件下培养长出菌丝，将单菌落菌丝转移至FIM培养基中继续培养并不断纯化，得到一株脆柄菇属真菌菌株，接种到铺满山兰种子的燕麦培养基中，并用无菌琼脂块设置对照组，计算山兰种子的萌发率和原球茎形成率，可在山兰种子繁育中加以应用。

主权项：1.一种利用脆柄菇属真菌促进山兰种子萌发的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：分离和鉴定适合促进山兰种子萌发的脆柄菇属真菌菌株选择生长在长白山区系的野生成年山兰苗根部，利用徒手切片技术及CH3COOH黑墨染色技术在高分辨率光学显微镜下寻找有菌丝团的根段，将含有真菌丝团的根段在流水条件下冲洗48小时，用无菌吸水纸吸干根段的多余水分后放入超净工作台，用高温灭菌后的镊子将根段夹到2％次氯酸钠溶液中浸泡30秒后，转移至装有75％酒精中烧杯，轻晃1分钟，再放至于无菌水烧瓶中清洗后吸干多于水分，备用；在超净台中，使用高温灭菌后的刀片和镊子将吸干水分后的根段切成1mm左右的薄片，将根段薄片平铺在FIM培养基中，于28℃和12h光照条件下培养，待根段薄片周围长出菌丝时，将单菌落菌丝转移至FIM培养基中继续培养并不断纯化，直至获得单菌落菌株；将装有真菌的2mlEP管中加入300μL、80mmolLTris裂解液、2ml的CTAB，高频震荡3min，放入80℃水浴锅中水浴加热融解10min，目的是尽量的让真菌细胞壁内的DNA释放至溶液中，将EP管依次加入500μL等体积的氯仿和异戊醇，手动摇晃3min，在8000g的离心机中离心8min，吸取上清液500μL，放冰箱4℃环境中静置12h，选取沉淀DN用75％酒精洗涤沉淀2次，12000g离心机3min，静置沉淀物，待其中的酒精完全挥发，取50μLTE缓冲液加入沉淀物中彻底溶解DNA，备用；S2：对选定的脆柄菇属真菌菌株进行形态学观察和生物学特性测定菌根真菌形态特征观察，将选定的真菌接种到FIM培养基中，当菌丝长至培养基表面23时，利用光学显微镜观察菌丝形态特征，从菌丝接入到培养基时间起，每8h在统计分析菌丝的生长速度和变化，同时，对菌落形态进行观察和统计分析；选取的菌株在接种到培养基后第3天开始迅速生长，在10天后长满培养基全皿，在7d生长速度最快，平均生长速度为0.56cmd；真菌的菌落正面布满规则状气生绒毛菌丝并呈白色不透明状，背面黄白色同心圆结，不产孢子；菌丝平均直径9.32μm，有隔膜，无直角分支；菌根真菌生物学特性测定，将分离鉴定出的脆柄菇属Psa-2菌株活化后，取0.3*0.3cm真菌琼脂块，真菌面朝上，置于含碳、氮、PH4～8、温度10～35℃，的FIM培养基条件下培养统计分析真菌的生长发育数据，在培养皿背面划线，统计分析菌丝生长速度；S3：对山兰种子进行形态学观察和不同萌发阶段划定山兰种子形态学观察，使用体视显微镜和电子学显微镜，对山兰种子进行种子整体形态和微观结构进行观察，含有水分的山兰种子整体呈褐色，干燥状态下种子呈深棕色，梭形，一头细长，一头略圆，胚乳在较粗的一端，长约1000μm，宽约250μm，种皮表面呈网格状，每个网格内部都有絮状结构；山兰种子不同萌发阶段的观察，选取未开裂、饱满的蒴果洗净后，流水冲洗24h，于2％次氯酸钠溶液中浸泡3min，再依次用无菌水冲洗3～5次，在超净台中，用镊子和解剖刀沿隔膜线纵向划开果皮，轻抖果实将种子均匀播铺到4.0gL、8.0gL、12.0gL燕麦培养基表面，将脆柄菇属菌株切割为0.3*0.3cm的真菌琼脂块，接种到铺满山兰种子的燕麦培养基中，并用无菌琼脂块设置对照组，为排除污染干扰，设置15个重复，接种后每天观察和统计种子的萌发情况，计算山兰种子的萌发率和原球茎形成率，并对山兰种子萌发过程进行观察统计分析，将山兰种子萌发的动态过程划分为5个阶段；S4：脆柄菇属真菌促进山兰种子萌发的条件筛选山兰种子萌发过程中，种子出现顶端分生组织时到第一片真叶形成之间的状态称为原球茎时期，在这之后种子会变成幼苗状态，再逐渐发育形成植株，在山兰种子萌发的初期阶段，本试验借助体视显微镜对4.0gL、8.0gL、12.0gL燕麦培养基表面的种子生长发育情况进行观察和统计分析，待共生培养超过2周时，菌丝体会长满培养基表面，需要定期将多余的菌丝在超净工作台中去除；脆柄菇属菌株促进山兰种子萌发的相关数据如下：真菌与山兰种子共培养100d时开始萌发，大量种子明显吸水变大，165d时达到最大萌发率，统计计算结果得出，接入真菌的处理组中山兰种子均出现萌发迹象，而接入无菌琼脂块的对照组种子没有任何萌发迹象，处理组的萌发率都要显著高于对照组，且具有明显差异；促进山兰种子萌发试验中，4.0gL和12.0gL燕麦培养条件下的山兰种子萌发率分别为20.11％和31.07％，种子都发生了吸水膨胀现象，种子种皮都发生破裂，膨大至球形，且与脆柄菇属菌株共生萌发的种子发育的最后阶段就是膨大至透明的白色球状，即萌发阶段1；8.0gL燕麦培养条件下的种子萌发率最高接近55.26％，其中大部分种子处于萌发阶段2，种皮完全破裂，种胚吸水膨胀成透明白色球体，少部分种子发育到3～4阶段，长出第一片真叶，原球茎形成率大约30％。

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