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摘要：本发明公开了一种深海甲烷渗漏区双壳贝类体内微塑料的分尺寸层级递进提取和鉴别方法。本发明提出的方法将生物组织冷冻干燥脱水、使用pH阶段性增强酶‑过氧化氢混合消解液、层级递进真空抽滤、分尺寸优势鉴定等若干实验步骤将极端环境中双壳贝类蕴含的微塑料无损且分类提取而出，目的在于实现双壳贝类体内全尺寸微塑料分尺寸范围进行定量和定性分析。本发明适用于探寻深海极端生态系统中双壳贝类各组织富集微塑料的表征方法，搭配捕获的海底贝类床层，进而推演到整个极端生态系统吸纳微塑料的时间历程及历史积累量，解决在深海极端环境中大规模采样提取分析的难题，为特定海域微塑料污染历史的影响提供科学的检验方略。

主权项：1.一种深海甲烷渗漏区双壳贝类体内微塑料的分尺寸层级递进提取和鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、冷冻保存：将捕获的双壳贝类冷冻保存；S2、组织预处理：将步骤S1冷冻保存的双壳贝类经恒温解冻、密闭解剖后，得到双壳贝类的各类生物组织，双壳贝类的各类生物组织经冷冻干燥后待用；S3、酶溶液预消解：向步骤S2得到的双壳贝类的各类生物组织中加入供消解的胰蛋白酶溶液消解，得到具有较多组织丝状凝结体的酶溶液一次消解液；S4、pH阶段性增强：使用pH调谐液将步骤S3得到的酶溶液一次消解液pH调整到7.5，再向酶消解液中若干次加入胰蛋白酶溶液以加速丝状凝结体的解体，得到酶溶液二次消解液，每次加入的胰蛋白酶溶液的体积是步骤S3中供消解的胰蛋白酶溶液的体积的13-14；S5、30％过氧化氢消解：将步骤S4得到的酶溶液二次消解液中的丝状凝结体挑出，向丝状凝结体中加入质量分数为30％的过氧化氢溶液，于60℃-65℃下消解残留的细胞粘接物，持续2-4h，直至消解液无气泡产生，即完全消解获得无明显悬浮物的近乎透明溶液，得到过氧化氢消解液；S6、混合消解液分尺寸层级递进提取：将步骤S4得到的酶溶液二次消解液以及步骤S5得到的过氧化氢消解液混合，进行第一尺寸层级提取，使＞10μm的所有目标物全部富集至滤膜上，得到第一尺寸层级提取滤膜，再将第一层级过滤液进行第二尺寸层级提取，使1～10μm的所有目标物全部富集至滤膜上，得到第二尺寸层级提取滤膜，再将第二层级过滤液进行第三尺寸层级提取，使0.1～1μm的所有目标物全部富集至滤膜上，得到第三尺寸层级提取滤膜；S7、对步骤S6得到的第一尺寸层级提取滤膜、第二尺寸层级提取滤膜和第三尺寸层级提取滤膜中的微塑料依次通过特征观测、微观成像和组分光谱检测，获取双壳贝类体内各生物组织全尺寸微塑料的分尺寸丰度信息。

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