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摘要：本发明提供Timd4基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法及应用，靶向山羊乳腺上皮细胞Timd4基因的gRNA，构建Timd4基因过表达山羊乳腺上皮细胞。该方法包括：利用基因编辑技术，将编码Timd4基因的启动子替换为内源性强表达b‑actin基因的启动子。本发明设计了特异靶向Timd4基因的gRNA，利用Cas9蛋白向Timd4基因的5’UTR前插入内源性强启动子，从而达到对乳腺上皮细胞进行基因过表达的目的。利用本发明方法得到的Timd4基因过表达的山羊乳腺上皮细胞，可有效保护乳腺上皮细胞免受LPS诱导的炎症反应。本方法提供了一种构建Timd4过表达的方法，为乳腺炎基因治疗领域提供理论支持。

主权项：1.Timd4基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法，其特征在于，利用基因编辑技术，将编码Timd4基因的启动子替换为内源性强表达b-actin基因的启动子，将Timd4基因过表达，获得稳定过表达山羊Timd4基因的原代乳腺上皮细胞；具体包括如下步骤：S1.修复片段b-actin启动子的扩增：以山羊的基因组DNA为模版，通过PCR扩增b-actin启动子并纯化；所述b-actin启动子的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；S2.Timd4基因左同源臂、右同源臂的扩增：以山羊Timd4的基因组DNA为模版，将Timd4基因5’UTR前后各1kb作为左、右同源臂，进行PCR扩增并纯化；所述Timd4基因左同源臂的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；Timd4基因右同源臂的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；S3.Donor线性骨架制备：将pZ-Tomato质粒经SalI内切酶和HindIII内切酶双酶切，纯化，获得Donor线性骨架；S4.构建pZ-Tomato-Timd4质粒：将S1获得的b-actin启动子、S2获得的Timd4基因左同源臂、右同源臂片段进行酶切，连接，获得同源臂片段：左同源臂-启动子-右同源臂；将所述同源臂片段与S3获得的Donor线性骨架连接，构建pZ-Tomato-Timd4质粒；S5.构建pX459-Timd4质粒：确定Timd4基因启动子的PAM位点，构建双链gRNA片段；pX459载体BbsI酶切后，将双链gRNA片段连接pX459质粒载体，获得pX459-Timd4质粒；S6.将S5获得的pX459-Timd4质粒和S4获得的pZ-Tomato-Timd4质粒按照质量比1:1电转入山羊乳腺上皮细胞，抗性筛选，得到稳定过表达山羊Timd4基因的乳腺上皮细胞。

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百度查询： 中国农业大学 Timd4基因过表达的山羊乳腺上皮细胞的构建方法及应用