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摘要：本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于生产观蓝的大肠杆菌基因工程菌及其构建与应用。所述大肠杆菌基因工程菌由表达载体pRk‑bpsA导入底盘菌株构建得到；所述底盘菌株为菌株IN05经过基因修饰而成，所述基因修饰包括敲除乳酸脱氢酶ldhA基因、谷氨酸‑5‑激酶proB基因、丙酮酸激酶pykF基因，并将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶entD基因以及经过点突变的谷氨酰胺合成酶glnA*基因整合至特定位点中构建得到。本发明的基因工程菌株，利用葡萄糖为底物在体内生成大量的谷氨酰胺用于合成观蓝，可以减少抗生素的使用，提高转化率，降低生产成本，绿色环保，可进一步推动工业化生产进程。
主权项：1.一种用于生产观蓝的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌基因工程菌由表达载体pRk-bpsA导入底盘菌株构建得到；所述表达载体pRk-bpsA是以pRK-bpsA-entD为质粒模板，分别通过引物PCR扩增得到bpsA片段和pRK质粒骨架，再将bpsA片段与pRK质粒骨架连接构建而成；所述底盘菌株为菌株IN05经过基因修饰而成，所述基因修饰包括敲除乳酸脱氢酶ldhA基因、谷氨酸-5-激酶proB基因、丙酮酸激酶pykF基因，然后在敲除的乳酸脱氢酶ldhA基因和谷氨酸-5-激酶proB基因的位点均整合磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶entD基因，在敲除的丙酮酸激酶pykF基因位点整合经过点突变的谷氨酰胺合成酶glnA*基因；所述经过点突变的谷氨酰胺合成酶为将谷氨酰胺合成酶glnA基因编码的谷氨酰胺合成酶的第405位氨基酸Y突变为A、E、F中的任一种。
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