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摘要:本申请属生物医药领域,具体涉及一种检测肺炎支原体及其23SrRNA基因耐药位点突变的生信分析方法。本申请针对病原宏基因组高通量测序数据,采用生物信息学的分析方法,可以快速检测该样本是否感染了肺炎支原体以及23SrRNA基因2063、2064、2067以及2617四个位点的碱基突变情况。在肺炎支原体鉴定上,与传统的分离培养法相比,本申请提供的方法更加快速并且成本更低;在耐药突变检测上,也与传统的通过设计突变位点的特异性PCR引物的方法有所不同;此外,本申请还根据位点的碱基组成发明了一种突变分析方法,不再单纯依赖现成的变异检测软件;本申请提供的方法具有检测灵敏度高、特异性强、重复性好,所需时间短等优点,适用于肺炎支原体及其23SrRNA耐药位点的检测。
主权项:1.一种检测肺炎支原体及其23SrRNA基因耐药突变的生物信息分析方法,其特征在于,包括以下步骤:S-1.准备数据包括NCBI数据库标注的肺炎支原体参考基因组、23SrRNA基因的序列、hg19版本的人类参考基因组以及转录组序列、炎黄一号人类基因组、T2T-CHM13人类参考基因组序列、mNGS临床样本以及阴控样本的二代测序数据;S-2.对mNGS临床样本以及阴控样本的二代测序数据进行数据质控;S-3.质控后的数据往人源序列数据库上进行比对,以去除人源序列;S-4.将步骤S-3获取到的序列往肺炎支原体参考基因组上进行比对,并采用samtools软件对比对结果进行处理;S-5.制定比对序列筛选条件并从步骤S-4的比对结果中提取满足条件的序列,具体筛选步骤如下:1比对到肺炎支原体参考基因组上的平均测序质量值大于等于30且比对质量值大于等于30的read数目N大于等于10条;2只比对到肺炎支原体参考基因组上的平均测序质量值大于等于30且比对质量值大于等于30的read数目大于等于2条,也即唯一比对的read数目大于等于2条;3临床样本以及阴控样本的均一化之后的比对read数之比大于等于5;该比值即为Foldchange值,如果阴控样本中没有满足条件的read检出,则Foldchange为正无穷;所述样本均一化方法如下:均一化后的序列数=20*N*0.000001样本大小则:Foldchange=临床样本均一化后序列数阴控样本均一化后序列数;S-6.将步骤S-5满足筛选条件的比对序列往23SrRNA基因上进行比对,获取输出文件;S-7.基于步骤S-6输出文件,统计23SrRNA基因2063、2064、2067以及2617四个位点的A、C、G、T四种碱基以及N的个数,其中N表示测序时不确定是具体哪种碱基,ACGTN的数目之和为该位点的测序深度;S-8.制定筛选原则并对S-7中的碱基组成结果进行筛选,具体筛选条件包括:1发生突变的位点在单条链的占比不得超过90%;2突变频率大于等于50%且突变read数目大于等于2;3突变频率大于等于5%且小于50%且突变read数目大于等于2且突变位点总深度大于等于10;在条件1满足的基础上,条件2或条件3满足任一个,筛选输出的碱基组成结果为可信突变结果。
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