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摘要：本发明公开了一种消除交叉污染的闭管可视化PCR检测方法。在PCR反应之前利用Cas12a蛋白的顺式切割活性特异性地破坏管底的交叉污染物；利用PCR反应使管底的Cas12a蛋白变性，消除其对PCR反应的抑制作用，获得扩增产物；利用海藻糖对提高Cas12a蛋白热稳定性的作用、矿物油隔热的作用和PCR仪器的管盖控温的作用，防止管盖上的Cas12a蛋白失活，从而利用其反式切割活性特异性地检测扩增产物，实现了交叉污染消除、PCR扩增和荧光可视化检测的闭管联用。该方法具有特异性强、准确性高、操作及引物、crRNA、探针序列设计简单、闭管操作、高效消除交叉污染的特点，为核酸定性分析提供了新的途径。

主权项：1.一种非疾病诊断目的消除闭管可视化PCR检测交叉污染的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：1）设计用于特异性扩增目标片段的正向引物和反向引物，并在正向引物、反向引物的5’末端分别插入PAM位点，得到PCR引物，所述PCR引物由第一引物和第二引物组成；根据插入正向引物、反向引物的相应PAM位点以及目标片段中所含有的PAM位点，设计对应的第一crRNA、第二crRNA以及第三crRNA；利用制备得到的PCR引物及crRNA，从而可以发挥Cas12a蛋白crRNA复合物特异性识别和顺式切割包含PAM位点的dsDNA的特性，并在闭管完成PCR反应后发挥伴随相应顺式切割发生的Cas12a蛋白crRNAdsDNA三元复合物对其附近的ssDNA进行反式切割的特性；2）将第一crRNA、第二crRNA、Cas12a蛋白、用于扩增目标片段的模板与包括PCR引物、DNA聚合酶、dNTP、Mg2+的PCR反应体系加载于反应管管底内，将第三crRNA、Cas12a蛋白及同时修饰有荧光基团和猝灭基团的单链DNA探针加载于反应管管盖内，从而在同一反应管中建立用于交叉污染消除、PCR反应与荧光可视化扩增产物检测的闭管联用体系，并利用该闭管体系消除扩增交叉污染和可视化PCR检测；3）在PCR反应之前利用加载于反应管管底内的Cas12a蛋白与第一crRNA和第二crRNA所形成的Cas12a蛋白第一crRNA复合物和Cas12a蛋白第二crRNA复合物水解交叉污染物；然后经PCR反应使加载于反应管管底的Cas12a蛋白失活，并在PCR反应中防止反应前加载在反应管管盖内的Cas12a蛋白失活；然后利用该Cas12a蛋白与第三crRNA及扩增产物所形成的Cas12a蛋白crRNAdsDNA三元复合物在PCR反应结束后水解同时修饰有荧光基团和猝灭基团的单链DNA探针，根据荧光显色结果即可判断目标片段得到扩增；所述步骤3中，PCR反应体系中Mg2+的浓度为1.5-2.5mmolL；所述步骤3中，水解的条件为37-45℃反应10-30min；所述步骤3中，在利用矿物油这一覆盖在PCR反应体系表面上的试剂的隔热封闭作用及PCR仪器对反应管管盖的控温作用基础上，结合加载在反应管管盖内的海藻糖的热稳定保护作用，从而使得加载在反应管管盖内的Cas12a蛋白在PCR反应的过程中不发生变性失活，而加载在反应管管底内的Cas12a蛋白在PCR反应的过程中则变性失活。

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