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摘要：本发明涉及一种分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶AO‑190mut及其制备方法，其方法主要包含少孢节丛孢菌几丁质酶AO‑190和AO‑223基因的扩增、克隆、少孢节丛孢菌几丁质酶AO‑190mut基因的分子改造及人工合成、少孢节丛孢菌‑AO‑190mut基因真核表达载体的构建和少孢节丛孢菌几丁质酶AO‑190mut在毕赤酵母菌中的诱导表达。与常规基因表达方法相比，本发明具有以下优势：首先，少孢节丛孢菌几丁质酶AO‑190mut基因经过酵母密码子优化后，重组丁质酶AO‑190mut的表达水平显著提高。其次，少孢节丛孢菌几丁质酶AO‑190基因经过末端分子改造后，制备出的丁质酶AO‑190mut具有更强的几丁质降解能力，其酶学活性显著提升。

主权项：1.一种分子改造的少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut的制备方法，其特征在于：包含以下过程：少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190和AO-223基因的扩增、克隆，少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut基因的分子改造及人工合成，少孢节丛孢菌-AO-190mut基因真核表达载体的构建与鉴定和少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut在毕赤酵母菌中的诱导表达；具体过程如下：少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190与AO-223基因的扩增、克隆：将少孢节丛孢菌菌丝接种在玉米粉琼脂培养基（CMA）上，在28（±1）℃真菌培养箱中培养10-12d，用灭菌蒸馏水洗脱分生孢子后加入YPSS培养基中进行扩培菌丝，5-7d后，通过无菌滤纸过滤收集菌丝，4（±1）℃保存，使用真菌RNA制备试剂盒提取总RNA，并使用PrimeScript反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别以FP1-RP1和FP2-RP2为引物进行几丁质酶AO-190与AO-223基因的PCR扩增，PCR体系组成为：PCRMix8-12µL、模板1.5-2.5µL及上下游引物各0.4-0.6µL，加ddH2O补至15-25µL体系，扩增几丁质酶AO-190基因的PCR反应程序：95（±0.5）℃4-6min;94（±0.5）℃20-30s，50-55（±1）℃，25-35s，70-75℃，60-80s，25-35个循环；最后70-75℃延伸8-12min，扩增几丁质酶AO-223基因的PCR反应程序：95（±0.5）℃，4-6min;94（±0.5）℃，35-45s，50-55℃，30-40s，70-75℃，150-170s，30-40个循环；最后70-75℃延伸8-12min；少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut基因的分子改造及人工合成：利用EXPASY软件对少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190基因及其编码蛋白序列进行分子特征分析，保留了几丁质酶AO-190的GH18家族几丁质酶保守域，同时，为增加几丁质酶AO-190的几丁质结合能力，在其N端引入少孢节丛孢菌几丁质酶AO-223的几丁质结合结构域（CBS1和CBS2），为保证各保守域功能独立，用柔性肽[（GSGSGS）3]进行区隔，此外，依据毕赤酵母密码子偏爱性，将少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut基因中毕赤酵母中编码Arg使用频率极低的密码子CGC、CGA、CGG、AGG突变为使用频率高的AGA，序列分析结果显示，在几丁质酶AO-190mut基因序列中，共发现了16个Arg毕赤酵母稀有密码子，因此在原序列的基础上同义突变了16个氨基酸位点序列，获得了分子改造后的几丁质酶基因AO-190mut，将AO-190mut序列进行全基因的人工合成；少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut基因真核表达载体构建与鉴定：根据构建的少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut基因序列，设计扩增几丁质酶AO-190mut基因的上下游引物FP3-RP3，用FP3-RP3引物从cDNA中扩增出目的基因AO-190mut，回收目的片段后与pMD19-Tsimple载体在4℃过夜连接，构建重组载体pMD19-AO-190mut，用XhoI和NotI将pMD19-AO-190mut和pPICZαA载体分别进行双酶切，回收目的片段，用T4连接酶于16（±1）℃过夜进行连接，连接体系：4-5μL目的基因片段，2-4μL载体片段，1-2μL缓冲液和0.5-1.5μLT4DNA连接酶，将连接产物转入大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞中，在氨苄LB平板进行筛选，挑取单菌落，通过菌液PCR及质粒双酶切筛选出重组表达载体pPICZα-AO-190mut；少孢节丛孢菌几丁质酶AO-190mut在毕赤酵母中的诱导表达：将重组表达载体pPICZα-AO-190mut用SacI进行线性化，并通过电穿孔方式转化入毕赤酵母GS115感受态细胞中，将电转后的细胞涂于MD培养基，28（±1）℃培养2-3d后将生长出的白色单菌落通过点种法转于含0.5-1.5mgmLG418的YPD固体培养基上，2-3d后挑选菌落转入含2-4mgmLG418的YPD培养基上，3-5d后继续挑选菌落点于含2-4mgmLG418的YPD培养基上，培养5-7d后，挑选培养基上的菌落，用FP3-RP3引物和5´AOX1-3´AOX1引物进行PCR鉴定，将筛选的重组菌接种到YPD培养基中，28（±1）℃下200-240rmin培养30-40h后离心收集全部菌体转入BMGY培养基中继续培养至OD600nm＞1.5，2000-3000rpm离心收集菌体，用灭菌蒸馏水洗涤2-3次后加入BMYY培养基重悬准备表达，在28（±1）℃、200-240rmin条件下加入甲醇至终浓度为0.5-1.5%，进行诱导表达，每隔22-26h收集1-3ml菌液并补加甲醇至终浓度为0.5-1.5%。

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