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申请/专利权人：厦门飞朔生物技术有限公司
摘要：本发明提供了一种改进的携带特异性分子标签扩增子文库的构建方法及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过对建库流程进行改进，仅需要初始扩增、消化反应、富集扩增三个流程便能完成携带特异性分子标签扩增子文库的构建，简单便捷；本发明引入特异性分子标签，在保留扩增子建库简单快捷等优势的同时，增强测序数据的准确性和可靠性，扩宽扩增子文库构建方法在液体活检方向的应用。实验证明，使用本发明方法构建的文库可以准确检测出ctDNA质控品中的阳性突变位点，突变频率低至0.1％的质控品也能准确检出；同时利用特异性分子标签的作用将扩增过程中引入的偏差有效过滤，四个ctDNA质控品均未检测出假阳性位点。
主权项：1.一种改进的携带特异性分子标签扩增子文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1根据实验目的，对特定基因或区域设计特异性引物，上下游引物的5’端依次添加4～6bp的特异性分子标签及桥接序列；所使用的基因为EGFR、KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA、HER2；设计的特异性引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.26所示；2配制初始扩增反应体系，加入所述特异性引物Mix，经过2个循环扩增反应，为每个起始模板的正义链和反义链各自添加上唯一的特异性分子标签；所述特异性引物Mix包括上游引物Mix和下游引物Mix；3初始扩增反应结束后，向反应体系中加入核酸外切酶ExoI将剩余特异性引物消化；4消化完成后，向反应体系中加入预扩增引物对和Index引物对进行富集扩增；扩增反应分两个阶段，第一阶段为低退火温度条件下的预扩增，利用预扩增引物对对携带特异性分子标签的模板进行富集放大；第二阶段为高退火温度条件下给模板添加上测序接头和Index序列；所述预扩增引物对和Index引物对序列如SEQIDNO.27～SEQIDNO.30所示；5反应结束后，利用磁珠进行纯化，纯化后产物可用于后续的上机测序；所述步骤4中的扩增反应程序为：98℃2min，98℃30s，60℃1min，72℃1min×10个循环，98℃30s，65℃4min×20个循环，4℃保存。
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百度查询： 厦门飞朔生物技术有限公司 一种改进的携带特异性分子标签扩增子文库的构建方法及其应用
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