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申请/专利权人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所

摘要：本发明公开了III型干扰素受体基因敲除的人结肠腺癌细胞系构建方法，利用CRISPRCas9基因编辑技术，构建IFNLR1基因敲除的Caco‑2细胞系，并通过外源性IFN‑λ刺激实验验证，与野生型Caco‑2细胞比较，IFNLR1基因敲除后Caco‑2细胞IFN下游激活通路没有被激活。构建好该细胞系后感染轮状病毒，与野生型细胞相比较，病毒浓度有明显增长，具有统计学意义。这说明本发明方法构建的细胞系在难培养轮状病毒的培养上起到作用。

主权项：1.III型干扰素受体基因敲除的人结肠腺癌细胞系构建方法，其特征在于，包括如下步骤：A1、特异性sgRNA设计：根据CRISPRCas9技术，在IFNLR1基因外显子区设计sgRNA，命名为IFNLR1-sgRNA，根据sgRNA插入载体的位置设计sgRNA插入鉴定引物，根据sgRNA靶向序列的位置设计PCR鉴定引物；IFNLR1-sgRNA引物如下：IFNLR1-sgRNA-1F：5′-CACCGCACTTCGCGCCACCGTCTA-3′IFNLR1-sgRNA-1R：5′-CGTGAAGCGCGGTGGCAGATCAAA-3′sgRNA插入鉴定引物如下：V2CX1876F：5′-CATAATAGCAACAGACATACAAAC-3′V2CX3763R：5′-CAAATCTAAAACGCTTAAATAGC-3′PCR鉴定引物：IL28R81F：5′-CCAGAATGTGACGCTGCTCT-3′IL28R787R：5′-TCTTTGCCCGCTGAAACC-3′IL28R115F：5′-GTGTACCTGACATGGCTCCCA-3′IL28R735R：5′-CCCTGCGGCAATTACTAACA-3′A2、LentiCRISPRv2-IFNLR1-sgRNA质粒的构建：将LentiCRISPRv2质粒利用BsmBⅠ酶切，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定的同时回收酶切后的线性化的LentiCRISPRv2质粒；将设计的IFNLR1-sgRNA引物利用荧光定量PCR仪将温度从95℃降至4℃，按照1℃min的速度进行退火处理；将线性化的LentiCRISPRv2质粒与退火形成的双链sgRNA利用T4DNA连接酶进行连接；然后将连接产物转化DH5α感受态细胞，孵育后挑取单克隆细胞，测序比对无误后进行去内毒素质粒提取，提取的质粒命名为LentiCRISPRv2-IFNLR1-sgRNA-3，记为质粒S3；A3、慢病毒包装及感染：将人胚胎肾细胞HEK293T进行接种，将S3进行慢病毒包装，将S3、psPAX2质粒和VSV-G质粒，利用细胞转染试剂转染至HEK293T细胞中，得到慢病毒液；将人结肠腺癌细胞Caco-2进行接种，将慢病毒液与含20％FBS的IMDM培养基加至接种了Caco-2细胞的孔板中，同时加入聚凝胺，进行感染；A4、单克隆细胞株筛选及培养：将步骤A3所得的感染后细胞的培养基更换为含20％FBS的IMDM，加入终浓度为2-3μgmL嘌呤霉素，进行传代及筛选；待对照组野生型Caco-2细胞全部死亡后，将筛选出细胞的培养基更换为含20％FBS的IMDM继续挑取单克隆细胞，利用有限稀释法获得稳定传代的单克隆细胞。

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