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申请/专利权人：北京林业大学

摘要：本发明属于植物基因工程领域，公开了一种在三倍体毛白杨中开展高效基因编辑的方法。包括如下步骤：1通过分析基因组结构特点，设计精准的gRNA，合成引物；2利用BsaI酶，再通过无缝克隆的方法将靶向目标基因的gRNA构建到基因编辑载体上；3原生质体中进行基因编辑效率的验证；4高效遗传转化和基因编辑，具体包括如下步骤：准备遗传转化的植株；将构建好的载体转化到农杆菌EHA105中；制备侵染重悬液：重悬液中加入石墨烯溶液；侵染三倍体毛白杨；侵染叶片和农杆菌的共同培养；抗性愈伤筛选；抗性芽的诱导、伸长、生根培养；5利用分子检测技术对基因编辑效率进行检测。本发明建立了高效基因编辑技术体系。

主权项：1.一种在三倍体毛白杨中开展高效基因编辑的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）通过分析基因组结构特点，设计精准的gRNA，合成引物；设计精准的gRNA包括如下步骤：克隆目的基因片段，查询三倍体毛白杨PtobZIP049基因序列，根据序列，设计如下引物：PtobZIP049-F:ATGGAGGAGGAATTCAACTCCCAACTPtobZIP049-R:TCAAGTTGTAACTAGGTGAGGACCAAT利用植物总RNA提取试剂盒，提取三倍体毛白杨cDNA，利用试剂盒制备cDNA；以三倍体毛白杨的cDNA为模板，克隆得到PtobZIP049基因的全长序列，克隆得到的所述PtobZIP049基因的全长序列如序列表SEQIDNO.1所示；根据PtobZIP049基因的全长序列，共设计出258条gRNA，根据分值排序，以及GC含量在40~60%之间，以及两个gRNA跨内含子为筛选条件，筛选出两条gRNA，GCTTCGTCTCACGGGTCTGG和CACCCATGGCGCCTTATCCA；2）利用BsaI酶，再通过无缝克隆的方法将靶向目标基因的gRNA构建到基因编辑载体上；3）原生质体中进行基因编辑效率的验证；4）高效遗传转化和基因编辑，具体包括如下步骤：准备遗传转化的植株；将构建好的载体转化到农杆菌EHA105中；制备侵染重悬液：将二次培养的EHA105农杆菌溶液，离心，收集沉淀；将收集的沉淀用重悬液重新悬浮，静置，然后加入石墨烯溶液使最终质量浓度为0.01~0.05‰，准备侵染；侵染三倍体毛白杨；侵染叶片和农杆菌的共同培养；抗性愈伤筛选；抗性芽的诱导、伸长、生根培养；5）利用分子检测技术对基因编辑效率进行检测。

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百度查询： 北京林业大学 在三倍体毛白杨中开展高效基因编辑的方法