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申请/专利权人：山东大学

摘要：本发明公开了一组FK228衍生物，分别是命名为FK228B的化合物1和命名为FK228C的化合物2，其化学结构如式I所示。该化合物是由伯克氏菌突变菌株BurkholderiathailandensisE264Δtdp::R‑tdp‑dep‑M4spi经过培养和液体发酵，从其发酵液中分离获得的。本发明还公开了所述FK228衍生物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。实验证实：所述伯克氏菌突变菌株产化合物1和化合物2的产量分别达到了985mgL和453mgL；且化合物1和化合物2能够明显抑制肿瘤细胞的生长，其抑制活性高于FK228。提示本发明提供的化合物有望增益其在抗肿瘤治疗中的应用价值，为新型抗肿瘤药物的开发和应用提供了新的备选化合物，具有显著的经济价值和社会效益。

主权项：1.一组FK228衍生物的制备方法，其中所述FK228衍生物是聚酮-非核糖体多肽杂合化合物，分别是命名为FK228B的化合物1和命名为FK228C的化合物2，制备步骤是：1利用敲除了thailandepsin的基因簇并在相应位置添加了attB位点构建的底盘菌BurkholderiathailandensisE264Δtdp为出发菌株，通过位点特异性重组将基因簇R-tdp-dep-M4spi整合到底盘菌BurkholderiathailandensisE264Δtdp原本表达thailandepsin的位置的基因组上，获得的工程菌株命名为伯克氏菌突变菌株BurkholderiathailandensisE264Δtdp::R-tdp-dep-M4spi；其中，所述FK228衍生物的工程菌株基因型为：BurkholderiathailandensisE264Δtdp、卡那霉素抗性基因、tdpR、tdpA、tdpB、tdpC1、tdp-spiDE1M4spi、tdpF、tdpG、tdpH、tdpI和tdpJ，是利用敲除了thailandepsin的完整基因簇并在相应位置添加了attB位点构建的底盘菌BurkholderiathailandensisE264Δtdp为出发菌株，通过位点特异性重组将基因簇R-tdp-dep-M4spi整合到底盘菌BurkholderiathailandensisE264Δtdp原本表达thailandepsin的位置的基因组上获得，具体构建方法是：1化学合成如GenBankNo.JQ045344.1所示序列的spiDE1基因中基因序列为spi基因簇中的Module4，将其命名为M4spi；2以pR6K-kan-ccdB质粒为模板，利用PCR技术获得kan-ccdB基因片段；3利用工程菌株E.coliGBred-gyrA462，通过线环重组方式将kan-ccdB片段整合在p15A-cm-R-tdp-dep质粒中，构建质粒p15A-cm-R-tdp-dep-kan-ccdB；4HindIII核酸内切酶切割p15A-cm-R-tdp-dep-kan-ccdB，获得线性片段p15A-cm-R-tdp-dep；5利用工程菌株E.coliGB05-dir通过线线重组方式将线性片段p15A-cm-R-tdp-dep和spiDE1基因组装成质粒p15A-cm-R-tdp-dep-M4spi；6利用工程菌株E.coliGB08-red，通过线环重组方式将质粒p15A-cm-R-tdp-dep-M4spi中的cm抗性基因替换为位点特异性重组元件kan-oriT-phiC31，得到质粒p15A-kan-oriT-phiC31-R-tdp-dep-M4spi；7通过位点特异性重组把质粒p15A-kan-oriT-phiC31-R-tdp-dep-M4spi整合到底盘菌BurkholderiathailandensisE264Δtdp的基因组上，得到工程菌株伯克氏菌突变菌株BurkholderiathailandensisE264Δtdp::R-tdp-dep-M4spi；2将伯克氏菌突变菌株BurkholderiathailandensisE264Δtdp::R-tdp-dep-M4spi二级种子按体积比1-5％接种量接入装液量为65mL发酵培养基的250mL摇瓶中，在28±1℃、180±20r·min-1的条件下培养56±2h；得到含FK228衍生物的发酵液；其中所述发酵培养基的配方是：葡萄糖10g·L-1，胰蛋白胨1.67g·L-1，K2HPO4·3H2O9.17g·L-1，KH2PO42g·L-1，柠檬酸钠0.5g·L-1，MgSO4·7H2O0.1g·L-1，pH7.0；3利用等体积的乙酸乙酯对发酵液进行萃取，重复3±1次，合并萃取液，低压浓缩干燥获得FK228衍生物的粗提物；4应用HPLC对粗提物分离纯化：以超纯水为流动相A，以色谱纯乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0-5min5％B,5-60min40％B,3mLmin，收集流份，低压浓缩干燥，获得FK228衍生物纯品，即式I所示化学结构的FK228B的化合物1和FK228C的化合物2；

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百度查询： 山东大学 一组FK228衍生物及其制备方法与应用