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申请/专利权人：昆明理工大学

摘要：本发明涉及原代细胞培养技术领域，具体涉及一种简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，本发明采用0.0625％低浓度胰酶进行短暂消化替代传统的高浓度胰酶或长时间摇床振荡。低浓度胰酶可以在保证细胞消化效果的同时，减少对细胞的机械损伤。胰酶消化过程中随时观察小胶质细胞的消化状态，避免过度消化，这种实时监控确保了细胞活力。在消化完成后，立即用完全培养基终止消化，迅速转移细胞，降低了胰酶对细胞的潜在损害。有效减少了细胞膜结构的破坏，保持了细胞的完整性和功能性，因此得到了状态良好、折光性强的小胶质细胞。

主权项：1.一种简便高效的皮层原代小胶质细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：胎鼠脑组织解剖，将预处理后的胚胎转入提前预冷的高糖DMEM培养基；S2：将步骤S1所得胎鼠分离获得皮层组织制备皮层单细胞悬液；将皮层组织剪碎，静止沉淀后弃上清并加入0.125％胰酶吹打混匀后转入一次性平皿并置于培养箱消化10min，期间取出平皿摇晃1次；加入等量完全培养基终止消化，轻柔吹打后将组织及上清转入15mL离心管，静止沉淀后吸取上清于新离心管，组织沉淀再次加入0.125％胰酶重复消化1-2次并收集全部细胞上清；所有细胞上清经40μm筛网过滤制备单细胞悬液后再转入新15mL离心管，800rpmmin离心3min后弃上清，加入分离培养基重悬细胞沉淀后转入提前用多聚赖氨酸包被过的T25培养瓶于培养箱培养；S3：基于步骤S2所得皮层单细胞悬液培养皮层原代小胶质细胞，向T25培养瓶中每隔2-3天补充3mL的新鲜维持培养基，培养至第10天，小胶质细胞呈现贴壁状态，倒置显微镜下可观察到细胞分层明显；弃上清，加入2-3mL的0.0625％胰酶，轻轻晃动培养瓶并随时观察小胶质细胞消化情况；待上层小胶质细胞消化脱落后，立即将消化液转移至15mL离心管并加维持培养基终止消化；视小胶质细胞情况再重复消化1-2次，收集全部小胶质细胞悬液，800rpmmin离心3min，弃上清加维持培养基重悬小胶质细胞；将小胶质细胞悬液以30万孔的密度铺于提前包被爬片的6孔板，培养30分钟后弃上清再添加维持培养基继续培养；S4：对步骤S3所得皮层小胶质细胞进行纯度鉴定，计算小胶质细胞纯度。

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