买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：瑞吉明(山东)生物科技有限公司

摘要：本发明属于肽制备技术领域，公开了一种高效率同步制备DNA锌盐和抗菌肽的方法，包括：将锌离子混合物与含有DNA分子的动物肝脏溶液在去离子水中混合，得到DNA锌盐；分别预制组合抗菌肽的原料，然后与制备好的DNA锌盐在缓冲剂作用下混合，得到DNA锌盐和抗菌肽组合物。本发明所提供的方法能够制备抗菌效果好的DNA锌盐和抗菌肽组合物，采用DNA锌盐和组合抗菌肽协同除菌方式，能够有效克服现有技术中纳米银尺寸较小，稳定性较差，不容易与细菌接触并渗透到细菌细胞中的问题。

主权项：1.一种高效率同步制备DNA锌盐和抗菌肽的方法，其特征在于，具体包括：将制备好的氧化锌、糖酸锌以及二氧化钛混合，得到锌离子混合物；所述锌离子混合物的制备方法，具体包括：取乙酸锌、乙二醇，并将乙酸锌、乙二醇混合，在65-75℃水浴环境下搅拌混合1-2小时，然后取0.2-0.25倍乙酸锌、乙二醇混合液体积的30％NaOH逐滴加入乙酸锌、乙二醇混合溶液中，在70℃环境下水浴搅拌5h，得到锌离子第一混合物；取锌离子第一混合物，将锌离子第一混合物投入温度为160℃的反应釜中反应18-24小时，取出反应后的锌离子第一混合物，采用3倍体积的无水乙醇洗涤3-5次，得到锌离子第二混合物；在500mL锥形瓶中装入200mL无机盐液体培养基，加入50mL高压灭菌处理后的无菌水，然后以黑曲霉种子作为接种菌株，采用平板划线法分离纯化黑曲霉种子，调节无机盐液体培养基的pH值为6.0-6.5，温度控制为25-34℃，在无机盐液体培养基中活化培养黑曲霉种子24小时，得到黑曲霉种子菌液；将培养好的黑曲霉种子菌液接种到含有300-350gL葡萄糖的发酵培养基中培养，所述发酵培养基的成分为碳源、有机氮源、七水合硫酸亚铁、磷酸二氢钾，在发酵过程中，控制发酵培养基pH值为6.0-6.5，温度控制为25-34℃，同时滴加消泡剂控制泡沫生成，发酵时间为20-25小时，发酵完毕后，将菌体与发酵液分离，得到葡萄糖酸钠发酵液；取葡萄糖酸钠发酵液置于反应釜内，将锌离子第二混合物加入葡萄糖酸钠发酵液中，控制反应釜的pH值为5.5-6，温度为36-40℃，反应时间为2-2.5小时，反应完毕后，过滤并浓缩滤液，加入乙醇结晶，并对结晶物进行真空干燥处理，得到锌离子第三混合物；将锌离子第三混合物分散于3倍体积的去离子水中均匀搅拌20min，将二氧化钛颗粒分散于2倍体积的去离子水中均匀搅拌20min，然后将锌离子第三混合物逐滴加入二氧化钛悬浮液中，超声搅拌混合3小时，采用无水乙醇和去离子水离心洗涤，在120℃条件下干燥处理6小时后，放入马弗炉中升温加热至450℃，并保存4小时，然后自然冷却至室温，得到锌离子混合物；将锌离子混合物与含有DNA分子的动物肝脏溶液在去离子水中混合，保持温度为30-45℃，锌离子混合物与DNA分子通过配位作用结合，形成Zn-Ti-DNA纳米结构，调整Zn-Ti-DNA纳米结构中Zn、Ti以及DNA分子的比例，得到DNA锌盐混合溶液；取DNA锌盐混合溶液离心处理，得到上清液C和沉淀物，对沉淀物烘干处理，得到DNA锌盐；所述锌离子混合物与DNA分子通过配位作用结合，形成Zn-Ti-DNA纳米结构的方法，具体包括：取动物肝脏溶液，向动物肝脏溶液中加入300UL牛胰岛素以及30％小牛血清，并向动物肝脏溶液中加入2倍体积的去离子水，搅拌混合30min后静置10min；向静置后动物肝脏溶液中加入0.03倍体积的900U木瓜蛋白酶、0.01倍体积的胰蛋白酶，在30-35℃环境下酶解3小时，在沸水浴中灭酶30min，冷却至10℃后搅拌，搅拌速度控制为2500-2800rmin，离心处理后，取上清液A；使用0.5μm的滤膜过滤上清液A，采用超滤装置对过滤后的上清液A进行分离纯化，得到上清液B；向锌离子混合物中加入4倍体积的去离子水，然后向锌离子混合物中加入0.5倍体积的二乙三胺五乙酸，锌离子混合物与二乙三胺五乙酸形成锌离子络合物；取上清液B，将锌离子络合物与上清液B在40-45℃环境下搅拌混合，在搅拌混合时滴加磷酸盐缓冲液，使得锌离子络合物与上清液B中DNA分子形成相匹配的配位键，反应3小时后，形成Zn-Ti-DNA纳米结构；取DNA锌盐混合溶液中上清液C，然后分别预制组合抗菌肽的原料，将组合抗菌肽的原料与上清液C混合，得到质量浓度为0.5-0.8％的组合抗菌肽，其中，组合抗菌肽由鱼精蛋白肽、胶原肽和LL-37抗菌肽组成；所述鱼精蛋白肽包括以下重量百分比的原料：鱼精蛋白：30％；乳清蛋白粉：10％；氯化钠：4％；纤维素酶：1％；柠檬酸：2％；乙醇：3％；去离子水：40％；胰蛋白胨10％；所述鱼精蛋白肽的制备方法，具体包括：取鲑鱼或鲤鱼的鱼精蛋白，用破壁机对鱼精蛋白进行破壁粉碎处理，得到鱼白匀浆；向鱼白匀浆中加入柠檬酸酸解，控制酸解的温度为45-50℃，在氩气保护下加压酸解2小时，得到酸解后的鱼白匀浆；利用胰蛋白胨、纤维素酶对鱼白匀浆进行酶解，并向鱼白匀浆添加去离子水，调节pH为6.5-7.0，温度为55-58℃，酶解时间为2小时，得到酶解液；取乳清蛋白粉溶于去离子水中，65℃环境下消毒杀菌1小时，冷却至室温，向乳清蛋白粉溶液中加入氯化钠、纤维素酶，得到乳清蛋白培养基，乳清蛋白培养基中还包括玉米秸秆酸解液、味精发酵废液、磷酸二氢钾；以嗜酸乳杆菌和双歧杆菌为混合菌株作为发酵菌株，并将嗜酸乳杆菌和双歧杆菌为混合菌株接种至乳清蛋白培养基中，保持乳清蛋白培养基的温度25-30℃、160-220rmin培养发酵20-25小时，得到乳清蛋白肽；取制备的乳清蛋白肽、酶解液与乙醇混合，并向乳清蛋白肽、酶解液混合液中滴加氯化钠，得到改性后的粗鱼精蛋白肽；采用0.5μm四层微孔滤膜对粗鱼精蛋白肽进行过滤，滤除大颗粒杂质，得到过滤后鱼精蛋白肽，然后用乙二醇沉淀杂质，对鱼精蛋白肽进行离心滤除，得到上清液D，采用凝胶过滤层析法对上清液D进行纯化，得到鱼精蛋白肽；所述胶原肽的制备方法，具体包括：取赖氨酸钠、甘氨酸钠、脯氨酸钠溶于去离子水中，得到钠盐混合溶液；以N-甲基吗啉为催化剂，加入去离子水溶解，然后将第一多肽混合物滴加至N-甲基吗啉溶液中，滴加完毕后，取三氯乙腈加入混合溶液中混合，在30-35℃环境下反应10-15min，然后取3倍体积的乙酸乙酯稀释，得到含有胶原肽中间体；在紫外灯照射环境下将胶原肽中间体投入V型混合容器中，然后添加N-杂环卡宾作用于胶原肽中间体，形成环状嵌段共聚的胶原肽；预制备生物酶活性剂以及稳定剂，将生物酶活性剂、稳定剂与组合抗菌肽在35-40℃环境下培养24小时，取出，然后与制备好的DNA锌盐在缓冲剂作用下混合，得到DNA锌盐和抗菌肽组合物；所述生物酶活性剂为蛋白激酶B、苹果酸脱氢酶、木瓜蛋白酶的混合物，且蛋白激酶B、苹果酸脱氢酶和木瓜蛋白酶的重量比为1:2:1；所述稳定剂为月桂基硫酸钠、二乙烯三胺五乙酸的1:1混合物。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 瑞吉明(山东)生物科技有限公司 一种高效率同步制备DNA锌盐和抗菌肽的方法