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申请/专利权人：吉林大学;吉林省农业科学院(中国农业科技东北创新中心)

摘要：本发明适用于基因检测技术领域，提供了CRISPRdCas9蛋白结合拉曼编码的转基因玉米检测方法，包括sgRNA的筛选、磁性聚合物微球‑dCas9‑sgRNA三元复合物的制备、磁性聚合物微球‑dCas9‑sgRNA三元复合物对目标转基因DNA的捕获以及荧光染料染色；荧光成像及拉曼编码检测；检测结果判别。本发明将CRISPRdCas9与拉曼编码技术相结合用于转基因农作物的多重检测，可以同时区分不同厂家的转基因品类，拓宽了CRISPR体系单一检测的限制。该检测方法能够高效、精准地检测转基因序列，具有操作简单的优点，对转基因作物的监管具有重要意义。

主权项：1.CRISPRdCas9蛋白结合拉曼编码的转基因玉米检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：针对三种转基因玉米Mon810-Cry1Ab、Mon810-Vip3Aa99和大北农-Vip3Aa的dsDNA核酸序列1、核酸序列2和核酸序列3，根据亲和性筛选出三条sgRNA，分别为sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，sgRNA中的crRNA部分是由可与目标DNA序列通过碱基配对进行特异性结合的20个核苷酸组成；步骤2：将三份1μL0.5μgμL的dCas9蛋白溶液分别与0.8μL1μgμL的sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3溶液混合，室温孵育10min，获得dCas9-sgRNA1、dCas9-sgRNA2和dCas9-sgRNA3的蛋白-核酸复合物溶液；步骤3：利用三种磁性聚合物微球表面的羧基和dCas9蛋白表面的氨基进行缩合反应形成酰胺键，三种磁性聚合物微球分别为微球11、微球12和微球13，将dCas9-sgRNA1、dCas9-sgRNA2和dCas9-sgRNA3分别修饰在微球11、微球12和微球13表面，形成三种dCas9-sgRNA复合的磁性聚合物球探针，分别为探针14、探针15和探针16；之后进行磁分离，清洗两次；步骤4：将步骤3获得的三种dCas9-sgRNA复合的磁性聚合物球探针按1:1:1体积比混合，获得混合探针溶液；步骤5：将2-10μL待测玉米样品的核酸提取液加入到20μL步骤4获得的混合探针溶液中，获得反应液，将反应液在37℃下反应30min，之后对反应液进行磁分离，并用纯净水洗涤两次后用20μL水重新分散探针；在步骤5中，若待测玉米样品的核酸提取液中存在三种目标核酸基因链段，即核酸序列1、核酸序列2和核酸序列3，则被捕获富集到相应探针的表面，将在反应液中获得目标基因-探针复合的微球；步骤6：在步骤5得到的溶液中加入荧光染料，继续孵育一定时间，再进行磁分离，洗涤两次；在步骤6中，若待测玉米样品的核酸提取液中存在三种目标核酸基因链段，即核酸序列1、核酸序列2和核酸序列3，荧光染料将插入到目标基因-探针复合的微球上的目标核酸链段；步骤7：将步骤6得到的目标基因-探针复合的微球放置在荧光显微镜下进行观察；若存在荧光明亮的微球，则存在Mon810-Cry1Ab、Mon810-Vip3Aa99和大北农-Vip3Aa转基因玉米的目标基因中的一种或多种；若无荧光明亮的微球，则不存在；步骤8：对步骤7中获得的荧光明亮的目标基因-探针复合的微球进行显微拉曼光谱采集，获得拉曼光谱信号；在步骤8中，阳性样本判别原则如下：若拉曼光谱信号与微球11信号对照一致，则Mon810-Cry1Ab转基因样本阳性；若拉曼光谱信号与微球12信号对照一致，则Mon810-Vip3Aa99转基因样本阳性；若拉曼光谱信号与微球13信号对照一致，则大北农-Vip3Aa转基因样本阳性。

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