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申请/专利权人：福建医科大学附属协和医院

摘要：本发明公开一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术准确诊断白血病细胞的工艺，实现以涂片细胞形态学技术为基础结合免疫标记技术准确检测血液骨髓涂片特定形态白血病细胞的免疫标记及诊断方法和工艺路线。将制备的三价镱离子和三价铒离子掺杂四氟钇钠上转换纳米颗粒经过修饰和抗体偶联制备出免疫荧光探针标记细胞用于细胞荧光场成像，结合瑞氏瑞‑姬氏染液复染后明场成像的细胞形态，实现同一视野内涂片血液肿瘤细胞的形态特点及免疫标记特征协同检测、评估。稀土上转换材料免疫荧光探针特异性好、荧光信号强，为实现以细胞形态学为基础的血液肿瘤细胞联合免疫标记准确诊断血液骨髓涂片血液肿瘤细胞提供了新方法。

主权项：1.一种基于稀土纳米材料免疫标记技术联合细胞形态学技术的非诊断目的的细胞成像方法，步骤如下：（1）上转换纳米材料的制备与修饰：在通氮气情况下，将含有Y3+的无机盐，Yb3+的无机盐，Er3+的无机盐和氟化氢钠在油酸和十八烯中反应，反应结束后分离得到纳米材料NaYF4:Yb3+,Er3+UCNPs；所述纳米材料为晶体，晶格间距为0.52nm，纳米颗粒尺寸为20～30nm；所述纳米材料经过盐酸酸洗和聚丙烯酸修饰后得纳米材料混悬液、备用；（2）免疫荧光探针的制备与偶联：使用N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）加入步骤（1）得到的纳米材料混悬液，室温下混匀，加入适量抗体，继续室温下混匀，离心除去未结合抗体，得沉淀物，将沉淀物加入纯水中，超声后离心，制得纳米材料-CD38抗体偶联物，以牛血清白蛋白（BSA）封闭，所得免疫荧光探针溶解于4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液，于4℃冰箱中储存备用；（3）待弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞生长至培养瓶的70~80%，观察其生长状态良好时，收集其细胞悬浮液，离心后用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞，用PBS配置细胞浓度为5×105mL；（4）取适量的免疫荧光探针加入细胞混悬液中，于室温孵育30分钟；（5）孵育完毕后，通过1000rpm离心力将标记后的细胞沉淀，未与细胞偶联的探针仍留在上清液中，移除上清液；加入PBS清洗细胞3次以除去未偶联的探针，得到免疫荧光探针-细胞偶联物；（6）取100μL所述的免疫荧光探针-细胞偶联物，与900μLPBS混匀后滴加到离心制片机或甩片机的沉降槽中，通过离心力将细胞移至粘附型玻片上，玻片于室温下晾干备用；（7）瑞氏瑞-姬氏染液染色方法，具体操作步骤为：滴加瑞氏瑞姬染液于粘附型玻片上，充分覆盖细胞分布区域5~10秒，滴加磷酸盐缓冲液为瑞氏瑞姬氏染液量1~3倍，将瑞氏瑞姬氏染液和缓冲液充分混匀，室温下染色20~40分钟，然后用流水进行冲洗，晾干备用；使用外接980nm激光器的倒置荧光显微镜进行成像，于明场下观察、聚焦、确定要观察CD标记的靶细胞、采集图像，然后切换激光光源，观察免疫标记显色情况，进行原位图像采集。

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